Skip to Content

Панель молекулярно-биологических и иммуногистохимических онкомаркеров при раке мочевого пузыря

ID: 2017-02-1276-A-13111
Оригинальная статья (свободная структура)
ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России

Резюме

Нет

Ключевые слова

рак мочевого пузыря, онкомаркеры

Статья

Введение. Рак мочевого пузыря является самым частым новообразованием мочевыводящих путейЕжегодно в мире раком мочевого пузыря заболевают 335,8 тыс. человек  и 132,4 тыс. человек, то есть  каждый третий  умирает от этого заболевания.   В 2011 году в Российской Федерации диагностировано 13784 случая РМП, при этом прирост этого заболевания за последние 10 лет составил 15,26%. Летальность от РМП на первом году с момента установления диагноза составляет 19,5% [1]. 

Сегодня в России под динамическим наблюдением находятся около 60 тысяч больных раком мочевого пузыря и только у 33,6% болезнь диагностируется на Т1 стадии заболевания [2].  Известно, что именно стадия рака мочевого пузыря определяет вид, характер лечения и прогноз заболевания для пациента. Вместе с тем частота ошибок, при определении стадии рака мочевого пузыря   достигает 73% [3].

В настоящее время определение общепринятых критериев стадии рака мочевого пузыря:  глубина инвазии опухоли, степень дифференцировки клеток, поражение регионарных лимфатических узлов и т.д.,  не всегда приводят к положительному результату лечения. Это подтверждают и данные анализа отдаленных результатов лечения больных с одной и той же диагностированной стадией раком мочевого пузыря. У одних пациентов после органосохраняющей операции наблюдается благоприятный исход, у других – быстро развивается рецидив и прогрессия опухоли. Это можно объяснить не изученным биологическим потенциалом рака мочевого пузыря [4]

Хорошо известно, что по клиническому течению выделяют поверхностный (Tis, Ta, T1), инвазивный (T2 -T4) и метастатический рак мочевого пузыря.

В Российской Федерации выявление  больных с поверхностной формой рака (I стадия) составляет лишь 33,6%, в противоположность зарубежным данным, в соответствии с которыми I стадия рака мочевого пузыря диагностируется в 80% наблюдений.  В нашей стране в 11,6-15,6% наблюдений выявляется IV стадия  рака мочевого пузыря [5]

Эти цифры не внушают оптимизма и отражают неудовлетворительную диагностику поверхностного рака мочевого пузыря,  позднюю обращаемость пациентов и неточное определение стадии заболевания и как следствие - неадекватность проводимого лечения – органоуносящие операции со снижением качества жизни больных и более высокая смертность. 

Анализ результатов лечения больных раком мочевого пузыря показал, что назрела необходимость поиска новых дополнительных маркеров ранней диагностики, установления стадии и определении прогноза заболевания.

В клинических рекомендациях, выпущенных по инициативе Российского общества онкоурологов с разрешения Европейской ассоциации по урологии, в 2011 году  сведения по применению конкретных молекулярных маркеров для диагностики рака мочевого пузыря отсутствуют. Нет их и в стандартах диагностики и лечения рака мочевого пузыря как  в России, так и в Европе. Все вышесказанное позволило нам сформулировать цель нашего исследования.

Цель исследования: разработать панели молекулярно-биологических и иммуногистохимических маркеров  для ранней  диагностики, стадирования и прогрессирования рака мочевого пузыря.

Материал и методы. Исследование проводилось в несколько этапов.  На первом этапе делали акцент на поиск маркеров для ранней диагностики  РМП и в рамках федеральной целевой программы по борьбе с социально-значимыми исследованиями  в 2008 году было начато исследование.

Проведено обследование 488 больного, находившихся  на лечении в НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии Саратовского государственного медицинского университета им. В.И.Разумовского  с диагнозом рак мочевого пузыря: 443 человека - основная группа,  группа контроля – 25 практически здоровых лиц,   группа сравнения -  20 пациентов  с циститом и мочекаменной болезнью.

Возраст пациентов с раком мочевого пузыря колебался от  44  до 79 лет (средний возраст - 63 года).  В числе обследованных пациентов  - 60 женщин и 383 мужчин. Из 443 пациентов  с раком мочевого  пузыря   в группу с поверхностным раком (Та-1N0M0) – включены 217(48,9%) человек, мышечноинвазивным раком  без метастазов(T2-4N0M0) – 188(42,4%) человек и с метастатическим раком было- 38(8,6%) больных.

При гистологическом исследовании у всех 443 больных диагностирован переходноклеточный рак. По степени дифференцировки опухоли больные были распределены следующим образом: 223(50%)  больных с высокодифференцированной опухолью (G1), 174(39%) больных с умереннодифференцированной опухолью (G2), 60(11%) больных с низкодифференцированной опухолью (G3).

Исследование содержания онкомаркеров, цитокинов, факторов ангиогенеза проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа. Определение онкомаркеров-фрагментов цитокератинов проводили в сыворотке крови и моче.  

Содержание факторов роста эндотелия сосудов, трансформирующего фактора роста, фактора роста фибробластов определяли в сыворотке крови, маркеры апоптоза, интерлейкина-12, фактора некроза опухоли исследовали во взвеси мононуклеаров в плазме.

Иммуногистохимические реакции проводили на серийных парафиновых срезах,  используя  стрептавидин-биотиновый метод. Для иммуногистохимического исследования были использованы 13 коммерческих моноклональных антител, разделенные на группы по функциональной значимости:  маркеры пролиферативной активности; супрессор опухолевого роста;  маркеры апоптоза;  рецептор эпидермального фактора роста;   цитокератиновый профиль.

Интенсивность реакций, локализованных в цитоплазме, оценивали полуколичественным способом по 3-х балльной шкале.

Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию,  оценивали в процентах, подсчитывая количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения.

Статистический анализ проводили с использованием стандартного пакета программ статистической обработки результатов. Общая диагностическая эффективность количественных тестов определена с помощью ROC-анализа.

Результаты. Проведенные исследования на 13 иммуногистохимических и 11 молекулярно-генетических маркерах позволили выбрать наиболее информативные маркеры ранней диагностики  рака мочевого: определение онкомаркера рака мочевого пузыря (UBC) в моче; фрагмента цитокератина ТРS  в сыворотке крови  и маркеров пролиферативной активности  Кi67, Р63 и антигена  пролиферирующего клеточного ядра в тканях опухоли методом иммуногистохимии. 

Были установлены значения в разных группах: у практически здоровых лиц, с заболеваниями мочевого пузыря неопухолевой природы и РМП (табл. 1).

По нашим данным повышение маркера UBC в моче больше чем 50,1 мкг/л – это повод для детального обследования  пациента. Резкое увеличение данного маркера в крови  определяется при начале инвазии опухоли в мышечный слой.

При прорастании опухоли в сосуды, фрагменты этих же цитокератинов (ТРА и ТРS) появляются в кровотоке.  Нарастание  содержания  этих маркеров в сыворотке крови коррелирует со степенью  инвазии опухоли.

Из всех изучаемых маркеров роста наиболее значимым в диагностике рака мочевого пузыря оказался фактор роста эндотелия сосудов. Его резкое увеличение является неблагоприятным фактором  прогноза рака. Изменение уровня  факторов апоптоза (Fas и Fas-лиганда) можно использовать только в качестве прогностического фактора, так как их увеличение обусловлено процессом активного распада лимфоцитов, что неизбежно приведет к иммуносупресии и прогрессу опухолевого роста.

При анализе показателей экспрессии иммуногистохимических маркеров, имеющих ядерную локализацию, в различных группах больных с раком мочевого пузыря были получены следующие результаты:

Наиболее информативными были маркеры пролиферации (Ki67) и белки - регуляторы клеточного цикла  (Р53 и Р63) , которые не дают  экспрессии в группе сравнения.  Кроме того, при применении маркеров  Ki67и  Р53 отмечена высокая степень  корреляционной зависимости  между стадией рака мочевого пузыря, процентом экспрессирующих клеток и интенсивностью иммуногистохимической реакции. 

При иммуногистохимическом исследовании на антигены, локализованные в  цитоплазме, было установлено, что их экспрессия во всех исследованных группах больных является положительной. Достоверно значимых различий между группами больных по показателям иммуногистохимических реакций с цитокератинами не выявлено. 

И только цитокератин 18  продемонстрировал трехкратное увеличение количества экспрессирующих клеток уротелия  между группой сравнения  и группой больных с неинвазивным раком.

Таким образом, первый этап проведенных  исследований на 13 иммуногистохимических и 11 молекулярно-биологических  маркерах позволил установить следующие маркеры ранней диагностики: (UBC) в моче; фрагмента цитокератинов ТРS и TPA в сыворотке крови  и маркеров пролиферативной активности  Кi67, Р63 и антигена  пролиферирующего клеточного ядра в тканях опухоли методом иммуногистохимии. 

На втором этапе проведенных исследований была установлена связь изменений уровней цитокератинов TPA, TPS и UBC с признаками инвазии и стадией заболевания у больных РМП  с различным уровнем инвазии опухоли (табл. 2).

Как видно из представленной таблица  у больных с мышечно-инвазивным раком мочевого пузыря (Т2-Т4)  характерны   значения онкомаркера  UBС выше чем 64,1 мкг/мл,  ТРS >106,93 Ед/л и  TPA> 1,89нг/мл.  У больных с  раком мочевого пузыря без мышечной инвазии показатели этих онкомаркеров  - нижеуказанных величин. 

При определении чувствительности и специфичности каждого маркера мы получили достаточно высокие показатели  между этими показателями (табл.3).

Проведенный РОС – анализ показал статистически значимые различия между стадиями РМП по всем трем маркерам (табл. 4, рис. 1).

Далее нами был проведен сравнительный анализ ошибок в маркерной диагностике глубины инвазии опухоли на дооперационном этапе и в послеоперационном периоде с морфологическим исследованием (табл.5).

Было установлено, что при раке мочевого пузыря без мышечной инвазии наиболее целесообразно использовать уринальный онкомаркер UBC, так как у него высокая чувствительность (88%) в верификации и стадировании (82%) переходноклеточной карциномы и самая маленькая ошибка (16%). Не высокая  чувствительность и точность  в установлении стадии Та-Т1 с помощью TPA и  TPS вполне объяснима, так как появление их в сыворотке крови происходит при прорастании опухоли в стенку сосуда, что происходит при инвазивном росте.

При мышечно-инвазивном РМП сохраняется высокая чувствительность UBC, а  точность в определении стадии снижается, что может объясняться большим размерами опухоли и ее экзофитным ростом. В тоже время исследование сыворотки крови на TPA и TPS показывает значительное увеличение в точности стадирования и снижении величины ошибки.

Следует отметить, что для уточнения стадии РМП наиболее целесообразно применение одновременно всех трех онкомаркеров, так как это увеличивает чувствительность и специфичность применяемого метода, что подтверждается данными проведенного RОC-анализа.

Применение всех трех маркеров позволяет провести дифференциальную диагностику доброкачественного и злокачественного процессов,  поверхностного и мышечно-инвазивного РМП, а также уменьшить количество диагностических ошибок в определении стадии, которая по данным некоторых авторов составляет 68-72% [6]. В клинике урологии и НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии  СГМУ до применения маркерной диагностики общая ошибка в определении стадии  заболевания составляла 44, 25%, к  2012году она уменьшилась до 15,2%.  В 2012 году  на «Способ диагностики стадии инвазии рака мочевого пузыря» с применением данных маркеров был получен патент на изобретение.(№2454181 от 27.06.2012)

При иммуногистохимическом исследовании 12 онкомаркеров было установлено, что для диагностики стадии рака мочевого пузыря и прогноза заболевания рационально использовать только 4 маркера: Ki-67, p63, р53 и  EGFR (табл.6).

Как видно из представленной таблицы, данные маркеры не дают положительной экспрессии в группе сравнения, что может использоваться при дифференциальной диагностике РМП и других неоплазий. Кроме этого процент экспрессирующих клеток указанных маркеров позволяет судить о степени инвазии РМП, что является важным моментом для определения стадии заболевания, а, следовательно, и прогноза.

При анализе показателей экспрессии маркеров в каждую из стадий РМП, представленной было установлено, что маркер Ki-67 показал 100% экспрессию у пациентов со стадией РМП Т3 и Т4, в то время как в стадию Т2 его экспрессия составила только 56,5%, что является достоверным различием (табл. 7).

Исследования показали: Ki-67 можно весьма перспективно использовать для дифференциальной диагностики между Т2 и Т3-Т4, что является очень важным, так как выход опухоли за пределы органа свидетельствует о неблагоприятном прогнозе и именно поэтому этот маркер может быть использован как прогностический, способный повлиять на выбор тактики лечения у больных МИРМП.

С целью определения прогностической значимости были изучены отдаленные результаты лечения 27 больных РМП, чью судьбу удалось проследить на протяжении 5 лет. У всех пациентов при иммуногистохимическом исследовании ткани опухоли Ki-67 дал положительную экспрессию.

Из 27 больных РМП 11 пациентам было выполнено органосохраняющее комплексное лечение, включающее в себя трансуретральную электрорезекцию стенки мочевого пузыря вместе с опухолью и системную полихимиотерапию по схеме M-VAC (метотрексат, винбластин, доксорубицин, цисплатин). У 13 больных произведена цистэктомия, а шесть пациентов признаны иноперабельными, им осуществлялась только симптоматическая терапия (табл.8).

Из представленной таблицы видно, что из 27 больных РМП – 16 (59,2%) умерло. Из них 10 (62,5%) - в первый год. Из 10 умерших в первый год 9 (90%) пациентов имели экспрессию Ki-67 ≥ 30%. У всех 9 больных стадия заболевания была Тзb-T4N0-1M0-1.

В то же время из 11 больных РМП, которые прожили более 5 лет, в 73% случаев экспрессия  Ki-67 составила < 30%. Стадия заболевания у выживших больных была: Т1N0M0 - 4; Т2N0M0 - 6; Т3N0M0 - 1.

При мышечно-инвазивном РМП Т2N0M0-Т3-4N0-1M0-1 (22 больных) в первые 24 месяца умерли  14 (62%). Экспрессия Ki-67 у этих больных колебалась от 30 до 80%.

При органосохраняющем лечении больных в стадии Т1-Т2 (11 пациентов) в первые два года умерло 5 (45,4%) больных, у которых экспрессия Ki-67 составляла ≥ 30%. После цистэктомии (n=13) умерло 8 (61,5%), у 7 (87,5%) из них Ki-67 был > 30%. Из 11 пациентов, проживших 5 лет и более, только в двух случаях Ki-67 было > 30% (34% и 44%), у остальных 9 (82%) – Ki-67 был менее 30%.

Проведенная сравнительная оценка эффективности различных иммуногистохимических маркеров в определении стадии и прогнозе мышечно-инвазивного РМП показала, что наиболее эффективным маркером является маркер пролиферативной   активности – Ki-67. Установлено, что при экспрессии Ki-67 > 30%, независимо от способа  лечения, в 81,2% возможен рецидив заболевания и летальный исход в течение 24 месяцев. В то же время при значениях Ki-67 < 30% пятилетняя выживаемость составляет 70%.

Таким образом,  научно-исследовательская работа, проводимая и НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии более 6 лет, и являющаяся отражением интеграции  клинической урологии,  лабораторной диагностики и морфологии позволила вывить наиболее значимые маркеры в ранней диагностике, определении стадии и прогноза рака мочевого пузыря.   

Выводы

  1. Для раннего выявления рака мочевого пузыря, а также проведения дифференциальной диагностики между доброкачественным и злокачественным процессом,  целесообразно    определение онкомаркера рака мочевого пузыря (UBC) в моче; фрагментов цитокератинов ТРS,ТРА  в сыворотке крови  и маркеров пролиферативной активности  Кi67, Р63 и антигена  пролиферирующего клеточного ядра в тканях опухоли методом иммуногистохимии.  Применение данных маркеров  в НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии СГМУ  позволило  повысить выявление рака мочевого пузыря на 1стадии  с 18,1% в 2006 г. до 48,9% в 2011 г. и  увеличить число органосохраняющих операций за этот же период времени с 57%  до 82%
  2. Включение онкомаркеров UBC, TPA и TPS  в комплексную диагностику и стадирование рака мочевого пузыря позволяет провести дифференциальную диагностику доброкачественного и злокачественного процессов,  поверхностного и мышечно-инвазивного РМП и  снизить частоту диагностических ошибок  с 44,2% до 15,2%.
  3. Маркер пролиферативной активности Ki-67 может быть использован в качестве вспомогательного маркера  при выборе объема оперативного лечения (органосохраняющая операция или цистэктомия). Кроме того независимо от способа лечения в 81,2% случаев Ki-67 может предсказать неблагоприятный исход заболевания в течение 24 месяцев.
  4. Применение  молекулярно-биологических и иммуногисто-химических маркеров в диагностике рака мочевого пузыря позволило за последние пять лет увеличить  объем радикальных операций с 78% до 92,1% и уменьшить летальность у данной категории больных в первые 2 года после проведенного лечения с 32% до 15,9%

Литература

1.Чиссов В.И., Старинский В.В., Петрова Г.В./ Злокачественные новообразования в России в 2011 году(заболеваемость и смертность)//М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А.Герцена» Минздрава России. 2013. ил. 289 с.

2. Аполихин О.И.,Сивков А.В., Москалева Н.Г. и др. Анализ уронефрологической заболеваемости и смертности в Российской Федерации в 2010-2011 годах//Экспериментальная и клиническая урология 2013. №2, с.10-17.

3.Микич Д.Х.Органосохраняющее лечение при инвазивном раке мочевого пузыря / Микич Д.Х.// Онкоурология. 2005. №2.С.27-32.

4. Значение маркеров опухолевого роста и ангиогенеза в диагностике рака мочевого пузыря / П.В. Глыбочко, А.Н. Понукалин, Н.Б. Захарова, Н.К. Шахапазян //Онкоурология. 2009, №2. С.56-60.

5. Клиническая онкоурология. Под ред. Б.П. Матвеева. М.: 2011.

6. Лоран, О. Б. Онкоурология сегодня : проблемы и достижения / О. Б. Лоран // Мед. вест. 2007, № 13. С. 7-8.

Таблицы

Таблица 1. Показатели  маркеров UBC в моче и фрагментов цитокератинов 8(TPA) и 18 (TPS)- в сыворотке крови  практически здоровых лиц, с заболеваниями мочевого пузыря неопухолевой природы и РМП

Маркеры

Величина cut off с чувствительностью 80%

Диапазон

«серой зоны»

Величина cut off со специфичностью 80%

TPS

61,5 Ед/л

61,5-82,6 Ед/л

82,6 Ед/л

TPA

1,05 нг/мл

1,05-1,52 нг/мл

1,52 нг/мл

UBC

22,55 мкг/мл

22,55-50,1мкг/мл

50,1 мкг/мл

 

Рак маловероятен

Наличие рака не исключено

Наиболее вероятен диагноз РМП

Таблица 2. Диагностические диапазоны уровня онкомаркеров, применяемые для диагностики стадии инвазии рака мочевого пузыря

Стадия

UBC мочи

 (мкг/мл)

TPA сыворотки крови

(нг/мл)

TPS сыворотки крови

(Ед/л)

Ta-T1

22,55 - 64,1

 1,05 - 1,89

61,5 - 106,93

T2-T4

64,1 – 430>

 1,89 – 13,4>

106,93-821,8>

Таблица 3. Диагностическая чувствительность и специфичность онкомаркеров при определении стадии инвазии рака мочевого пузыря

Диагностика стадии рака

UBC мочи

TPA сыворотки крови

TPS сыворотки крови

Переход мышечно-неинвазивного рака (Та-Т1) в мышечно-инвазивный без экстарорганной инвазии (Т2-Т4)

>64,1 мкг/мл

Чувств. = 95%

Специф. = 69%

>1,89 нг/мл

Чувств. = 90,4%

Специф. = 91,5%

>106,93 Ед/л

Чувств. = 95,2%

Специф. = 85%

Таблица 4. ROC-анализ значимости онкомаркеров при диагностике мышечно-неинвазивного рака и инвазивного рака мочевого пузыря

Онкомаркеры

Площадь под кривой ± стандартное отклонение

Достоверность отличия (p) от незначимого теста (кривая х=у)

95% доверительный интервал

UBC

0,796±0,07

p=0,001

0,658-0,934

TPA

0,642±0,085

p=0,104

0,476-0,807

TPS

0,873±0,052

p=0,0001

0,771-0,975

Таблица 5. Сравнительный анализ ошибок в маркерной диагностике

Маркер

Значения

онкомаркера

Стадия   Т

до  операции

Стадия   р Т   после операции

Гипо-/ гипер-

диагностика

(%)

Общая ошибка

(%)

UBC

Моча

(Мкг/мл)

50,1-64,1

Ta-T1

n= 217

pTa-T1

n= 182

4  / 12

16%

64,1-430>

T2-T4

n= 226

pT2-T4

n=162

5 / 23,5

28,5%

TPA

сыворотка

крови

(нг/мл)

1,52-1,89

Ta-T1

n=217

pTa-T1

n=72

26 / 41

67%

1,89-13,4

Т2-Т4

n=226

pT2-T4

n= 200

4,5 / 7,1

11,6%

TPS

сыворотка

крови

(Ед/л)

82,6-106,93

Ta-T1

n=217

pTa-T1

N=78

44 / 20

64%

106,93-821,8

T2-T4

n=226

pT2-T4

Т=188

4,7 / 12,3

17%

Таблица 6. Сравнительная оценка эффективности иммуногистохимических маркеров при мышечно-неинвазивном и мышечно-инвазивном РМП

Исследуемые группы

Иммуногистохимические маркеры

р53

Ki-67

р63

EGFR

Группа сравнения T0N0M0  (n=14)

0

0

0

0

МНРМП Та-1N0M0 (n=24)

3 (12,5%)

12 (50%)

7 (29%)

1 (4,1%)

МИРМП

T2-4N0-1M0-1 (n=42)

19 (45,2%)

32 (76,1%)

23 (54,7%)

7 (16,6%)

Таблица 7. Показатели экспрессии иммуногистохимических маркеров РМП у больных в зависимости от стадии заболевания

     Стадия

      РМП

Количество больных в группе

Положительный результат

р53

Ki-67

PCNA

р63

EGFR

T0N0M0

14

0

0

64,2%

0

0

TaN0M0

15

13%

46,6%

13%

13%

0

T1N0M0

9

11%

55,5%

11%

55%

11,1%

T2N0M0

23

43%

56,5%

43%

52%

8,6%

T3N0-1M0

8

50%

100%

50%

75%

25%

T4N0-1M0-1

11

45%

100%

45%

45,4%

27,2%

Таблица 8. Методы лечения у больных РМП и % экспрессирующих клеток  Ki-67

% экспрессиру-ющих клеток

Ki-67

Кол-во

больных

Метод лечения

Выживаемость

Резекция МП,

ТУР+Х.Т.

Цистэктомия

Паллиативное

Умерли в

течение

 2-х  лет

Живы

5 лет и

более

Ki 67  ≤ 30%

  11  (40,7%)

  5 (45,4%)

     6 (54,6%)

    -

3 (27,2%)

8 (72,8%)

Ki 67 ≥ 30%

16 (59,3%)

  6 (37,5%)

     7 (43,7%)

    3(18,7%)

13(81,2%)

3 (18,8%)

Всего

27 (100%)

 11(40,7%)

     13 48,1%)

3 (11,1%)

16 (59,2%)

11 (40,8%)

0
Ваша оценка: Нет



Оптимальный хостинг для Drupal, Wordpress, Joomla, Битрикс и других CMS, быстрые и надежные сервера, круглосуточная техподдержка Яндекс.Метрика