Skip to Content

Активность экстракта аврана лекарственного (Gratiola оfficinalis l.) в отношении M. tuberculosis

ID: 2017-02-1276-A-13115
Оригинальная статья (свободная структура)
ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России

Резюме

В работе использовали водный раствор сухого экстракта Gratiola officinalis L., полученного авторским способом, повышающим выход биофлавоноидов и позволяющим удалять фракцию, содержащую алкалоиды, что приводит к получению нетоксичных целевых продуктов. Определена минимальная подавляющая концентрация (МПК) экстракта аврана на музейном, чувствительном штаммах Mycobacterium tuberculosis (МБТ) и штамме M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). При концентрации экстракта аврана 14 мг/мл отмечался полный бактерицидный эффект в отношении музейного штамма МБТ, при концентрации 26,6 мг/мл происходило полное подавление роста чувствительного клинического штамма МБТ и при концентрации 53,1 мг/мл – отсутствие роста штамма МБТ с МЛУ. Таким образом, доказана противотуберкулезная бактериостатическая и бактерицидная активность экстракта аврана лекарственного, исследуемая in vitro. При этом механизм действия явно отличается от механизма противотуберкулезных препаратов первого ряда, так как штаммы, устойчивые к ним, оказались чувствительны к экстракту аврана при определенных концентрациях в среде. Данный экстракт может быть рекомендован и рассмотрен для проведения доклинических и клинических исследований по лечению туберкулеза, поиску новых механизмов воздействия на M. tuberculosis, а также может стать перспективным препаратом для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью.

Ключевые слова

биофлавоноиды, лекарственная устойчивость, микобактерии туберкулеза, Mycobactérium tuberculosis, Gratiola officinalis L., авран лекарственный

Статья

Введение. Туберкулез органов мочевой системы — одно из наиболее распространенных урологических заболеваний, уступающее по частоте лишь неспецифическим воспалительным процессам, мочекаменной болезни и новообразованиям. По данным Мочаловой Т.П. и др. (1987) в структуре заболеваемости и болезненности данная патология в сочетании с туберкулезом половых органов (урогенитальный туберкулез) занимает первое место среди локализаций внелегочного туберкулеза, составляя 30—43%, в структуре инвалидности — второе место после костно-суставного туберкулеза.

Борьба с туберкулезом относится к одному из наиболее приоритетных направлений современной медицины [1]. Значимость этой проблемы возросла в последние десятилетия, когда после периода длительного благополучия, связанного с открытием и широким использованием противотуберкулезных препаратов, вновь стал отмечаться рост заболеваемости туберкулезом во всех странах мира [2]. С конца прошлого века эпидемиологическая обстановка по туберкулезу во всем мире вновь стала стремительно ухудшаться. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) за 2010 год в мире зарегистрировано 8,8 млн новых случаев заболевания [3]. По данным Онищенко Г.Г. (2008) и ВОЗ (2010 г.) в среднем заболеваемость туберкулезом в мире составляет 128 на 100 тыс. населения с ежегодным увеличением числа заболевших на 1 % [4,5], а в РФ, начиная с 1990 года, отмечался рост всех основных эпидемиологических показателей по туберкулезу. По данным ВОЗ в 2010 году заболеваемость туберкулезом среди взрослого населения в РФ составила 106 на 100 тыс. населения; с учётом экономической нестабильности в стране прогнозировался ее дальнейший рост [3,6]. Показатель заболеваемости выше 100 на 100 тыс. населения (эпидемический порог заболеваемости туберкулезом, установленный экспертами ВОЗ) был зарегистрирован в 24 субъектах РФ, на долю которых приходилось 28 % населения страны и 41,8 % впервые выявленных больных [3,6].

Одной из основных причин нарастания эпидемии туберкулеза во всем мире служит распространение лекарственно устойчивых форм заболевания, плохо поддающихся лечению ограниченным набором известных противотуберкулезных препаратов.

Лечение пациентов с лекарственно устойчивыми формами туберкулеза и, особенно, с множественной лекарственной устойчивостью – к двум основным препаратам: изониазиду и рифампицину – требует значительно более дорогостоящего и длительного лечения препаратами, вызывающими серьезные побочные реакции и имеющими широкий спектр противопоказаний [1,5]. Все это обусловливает необходимость поиска новых антимикробных средств с противотуберкулезным действием, нетоксичных и не обладающих выраженным мутагенным эффектом [7,8]. Одним из источников таких средств являются экстракты из лекарственного растительного сырья (ЛРС).

Известен ряд лекарственных композиций на основе экстрактов ЛРС – экстракт из цветков багульника, листьев подорожника, тимьяна, крапивы и др. используемые для лечения больных инфильтративным туберкулезом легких [2]. Преимущества имеют растительные экстракты, полученные многоступенчатым способом очистки от балластных соединений, направленным на увеличение выхода определенных соединений с уже известным действием. Перспективной группой противомикробного действия являются биофлавоноиды, представляющие собой растительные фенольные соединения [9].

Для проведения данного исследования нами выбрано растительное сырье – листья и цветки аврана лекарственного. При различных способах извлечения из сырья аврана можно получить биологически активные композиции, обладающие различными свойствами: слабительным, рвотным, спазмолитическим, диуретическим, дигиталисоподобным действием на сердце, антиканцерогенным, антиоксидантным [10], противоопухолевым, противовосполительным и антикахексическим [11-15]. Ранее нами была выявлена  антимикробная активность экстракта аврана лекарственного в отношение Staphylococcus àureus и Pseudomonas àeruginosa [13]. В связи с этим было высказано предположение  о возможной  противотуберкулезной активности аврана. По данным литературы, у ранее полученных извлечений из аврана лекарственного активность в отношение Mycobacterium tuberculosis не была выявлена.

Цель исследования: изучить активность водного раствора сухого спиртового экстракта аврана лекарственного в отношении подавления роста музейного и клинических штаммов M. tuberculosis и штамма M. tuberculosis, обладающего лекарственной устойчивостью к изониазиду и рифампицину.

Материал и методы. В работе использован водный раствор сухого спиртового экстракта цветков и листьев аврана лекарственного Gratiola officinalis L, приготовленного определенным способом [16], повышающим выход флавоноидов и позволяющим удалять фракцию, содержащую алкалоиды, что приводит к получению нетоксичных целевых продуктов [14,17-20].

Для экстракции использованы цветки и листья аврана лекарственного, собранные нами на территории Саратовской области. Экстракт, полученный данным способом из аврана лекарственного, имеет следующий химический состав: 4-винил-2-метоксифенол; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он; 2,3-дигидробензофуран; 3-фуранкарбоновая кислота; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; этил-a-d-рибозид; 4-пропилфенол; пирокатехин; L-луксоза (пентоза); 6-деоксигексоза L-галактоза; бензоилуксусной кислоты этиловый эфир; гексадекановая кислота (пальмитиновая кислота); гомованилиновая кислота; глюкоза; 1,4-ангидро- d-маннитол; бензойная кислота; кверцетин. Среднее значение кверцетина в данном экстракте с использованием градуировочного графика стандартного образца кверцетина (98%) Sigma, составляет 0,66%. Установленное нами методом жидкостной хроматографии количество кверцетина в сухом остатке экстрактивных веществ (получаемого из 10 г сухого сырья – цветков и листьев) составило 350 мкг [16,21].

Штаммы микобактерий туберкулеза были получены при посеве респираторного материала (мокрота) от больных, проходящих лечение в ГБУЗ «Тамбовский областной клинический противотуберкулезный диспансер», и тестированы с использованием стандартной методики оценки лекарственной устойчивости микобактерий на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена, не содержащей крахмал (HiMedia, Индия) методом абсолютных концентраций и путем полимеразной цепной реакции [1]. Методом абсолютных концентраций устанавливали степень устойчивости штаммов к противотуберкулезным препаратам первого ряда - рифампицину, изониазиду, стрептомицину и этамбутолу. Культуру МБТ расценивали как устойчивую к воздействию препарата/экстракта при наличии роста 20 колоний M. tuberculosis и более и как чувствительную при росте до 20 колоний. Музейный штамм M. tuberculosis оказался чувствительным к указанным выше лекарственным препаратам, и обозначен как чувствительный штамм. Второй клинический штамм оказался резистентным к противотуберкулезным препаратам (изониазиду, рифампицину, стрептомицину и этамбутолу), поэтому обозначен как штамм МЛУ.

Молекулярно-генетическое исследование анализируемых клинических штаммов на устойчивость к рифампицину и/или изониазиду проводили с помощью постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей гибридизацией генетического материала M. tuberculosis на биочипах «ТБ-БИОЧИП» (ООО «Биочип-ИМБ», Россия) по методике, рекомендованной производителем. Метод включал в себя выделение ДНК M.tuberculosis из респираторных образцов (мокроты), проведение двух последовательных мультиплексных ПЦР для увеличения числа копий ДНК, гибридизации продуктов амплификации второй стадии ПЦР на биочипе. Результаты гибридизации регистрировали на портативном анализаторе биочипов (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Россия) с соответствующим программным обеспечением. В результате оценки лекарственной устойчивости данным способом в генетическом материале первого клинического (чувствительного) штамма МБТ мутаций, приводящих к устойчивости к вышеупомянутым препаратам, не обнаружено, тогда как у штамма МБТ с МЛУ обнаружены соответствующие мутации: нуклеотидные замены в кодоне 531гена rpoB (устойчивость к рифампицину) и в кодоне 315 гена katG (устойчивость к изониазиду), приводящие к замене аминокислоты (табл. 1).

При исследовании активной бактериостатической и бактерицидной концентраций было заложено четыре линии культур: первая линия представляла собой положительный контроль (ряд из двух пробирок с каждым штаммом в отдельности без воздействия), вторая линия - ряд из двух пробирок без засева штаммами для исключения случайного роста МБТ (отрицательный контроль). Третья и четвертая линии были экспериментальными (культуры с двумя клиническими штаммами с разной степенью лекарственной чувствительности) и содержали по восемь пробирок с разными разведениями экстракта (от 1,7 до 212,5 мг/мл).

Установление минимальной подавляющей концентрации для экстракта аврана проводили по методу серийных разведений на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена, не содержащей крахмал (производство HiMedia, Индия) [1]. Водный раствор сухого спиртового экстракта добавляли к среде во время ее приготовления при температуре 20-25оС, равномерно распределяя его во всем объеме среды. МБТ засевали стандартного титра (содержание клеток, соответствующее 1x107 микробных тел/мл). Контроль роста колоний возбудителя туберкулеза проводили в течение 28 суток [1].

Исследовали также динамику роста музейного штамма H37Rv под действием экстракта аврана в концентрации 14 мг/мл. Наблюдения также проводили в течение 28 суток, но засевали на питательную среду два титра МБТ с содержанием клеток, соответствующим 50x107 и 500 x107 микробных тел в 1 мл.

Собственная модификация стандартного метода заключалась в замене абсолютных концентраций серийным разведением с целью определения порога концентраций экстракта, при преодолении которого рост МБТ не определялся.

Результаты и обсуждение.

Изучение динамики роста музейного штамма M. tuberculosis H37Rv под действием экстракта аврана лекарственного.

В обеих повторностях наблюдалось полное отсутствие роста колоний музейного штамма МБТ на среде с добавлением экстракта аврана в течение 28 суток при титре МБТ 50x107 (бактерицидный эффект), в то время, как в контрольных группах рост колоний отмечался с 10 дня (табл. 1).

При титре МБТ 500x107 в первой повторности отмечалось бактерицидное действие (отсутствие роста на всех сроках наблюдения), а во второй повторности единичные колонии музейного штамма МБТ на среде с добавлением экстракта аврана появлялись только на 10 сутки наблюдения, то время, как в контроле с 7 дня наблюдался уже умеренный рост, а на 10 день обильный рост колоний (2+ и 3+ соответственно).

Отсутствие роста колоний музейного штамма МБТ на среде с добавлением экстракта аврана в обеих проворностях при титре МБТ 50x107 и в первой повторности при титре МБТ 500x107 с 1 по 28 сутки наблюдения по сравнению с контролем, позволяют судить о наличии выраженного бактерицидного эффекта экстракта. Появление слабого роста при титре МБТ 500x107 во второй повторности с 7 дня и сохранение слабого роста (менее 20 КОЕ) до 28 дня под действием экстракта, по сравнению с контролем говорит о бактериостатическом действии экстракта аврана лекарственного на музейный штамм МБТ.

В соответствии с критериями оценки чувствительности МБТ, нами установлено, что в отношении чувствительного клинического штамма (без МЛУ) при концентрации экстракта аврана 13,3 мг/мл отмечался выраженный бактериостатический эффект (2 КОЕ), а при концентрации 26,6 мг/мл - бактерицидный эффект (Табл. 3).

В отношении штамма МБТ с МЛУ при концентрации экстракта аврана 26,6 мг/мл отмечалось бактериостатическое действие (18 КОЕ), а при концентрации 53 мг/мл - полное подавление роста культур (бактерицидное действие) (Табл. 3).

Таким образом, экстракт аврана лекарственного в концентрации – 26,6 мг/мл обладает бактерицидным эффектом на клинический штамм, чувствительный к противотуберкулезным препаратам, и бактериостатическим - на клинический штамм с МЛУ. Бактерицидный эффект на штамм с МЛУ наблюдается с концентрации раствора экстракта аврана в среде 53,1 мг/мл.

Нами выявлен подавляющий эффект экстракта аврана в отношении штамма M. tuberculosis как чувствительного, так и  с МЛУ. По-видимому, данный экстракт имеет иной механизм антибактериального действия, отличный от действия  противотуберкулезных препаратов I ряда (изониазид, рифампицин, этамбутол, стрептомицин), что требует дальнейшего изучения.

Заключение. Полученный экстракт аврана лекарственного обладает противотуберкулезным действием invitro. Доказана высокая противотуберкулезная (бактериостатическая и бактерицидная) активность экстракта аврана, исследуемая invitro. Данный эффект был показан, как на музейном штамме с оценкой динамики роста колоний, так и с помощью метода серийных разведений  на чувствительном клиническом штамме и штамме  с МЛУ. Определена МПК (минимально подавляющая концентрация) экстракта аврана на музейном, чувствительном штаммах и штамме с МЛУ. При концентрации экстракта аврана 14 мг/мл отмечался полный бактерицидный эффект в отношении музейного штамма МБТ, при концентрации 26,6 мг/мл происходило полное подавление роста чувствительного штамма МБТ (к изониазиду и рифампицину), а при концентрации 53,1 мг/мл происходило полное подавление роста штамма МБТ с МЛУ (устойчивому к рифампицину и изониазиду, а также стрептомицину и этамбутолу). Полученные результаты делают перспективным дальнейшее изучение действия экстракта аврана лекарственного, содержащего флавоноиды, на экспериментальных моделях туберкулезного процесса, а в дальнейшем и на клиническом уровне при разработке нового эффективного способа и формы доставки экстракта в организм больного туберкулезом. Механизм действия экстракта аврана лекарственного на молекулярном уровне требует дополнительных исследований.

Литература

1. Приймак А.А. Размышления о туберкулезе. Пульмонология. 2005. №5. С. 35-38.

2. Буркова В.Н., Бычкова Н.К., Патент Российская Федерация 2210379 2003.

3. Савилов Е.Д., Синьков В.В., Огарков О.Б. Эпидемиология туберкулеза на Евро-Азиатском континенте: оценка глобального движения штаммов генотипа «Пекин»,РИО ГБОУ ДПО ИГМАПО, Иркутск (2013)

4. http://www.who.int/tb/publications/2010/factsheet_tb_2010. pdf

5. Туберкулез в РФ 2011 г. Аналитический обзор статистических показателей, используемых в Российской Федерации и в мире, Москва, 2013.

6. Туберкулез – национальное руководство, М.И. Перельман (ред.), Москва: ГЭОТАР, 2007.

7. Приказ МЗ РФ от 21 марта 2003 г. N 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации».

8. Машковский М.Д. Лекарственные средства: пособие по фармакотерапии для врачей, 11-е изд., ч.1, Москва: Медицина, 1988.

9. Куркин В.А., Фармакогнозия: учебник для фармацевтических вузов (факультетов), 2–е изд., Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «СамГМУРосздрава» 2007.

10. Наволокин Н.А., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н. и др. Морфология внутренних органов и опухоли лабораторных крыс с перевитым раком печени РС-1 при пероральном введении флавоноидсодержащих экстрактов аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.) и кукурузы антоциановой (Zea mays l.). //Саратовский научно-медицинский журнал. 2013. Т.9., №2. С. 213-220.

11. Наволокин Н.А., Скворцова В.В., Полуконова Н.В. и др. Противотуберкулезная активность экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.) In vitro.  //Экспериментальная и клиническая фармакология. 2015. Т.78. №4. С.10-13.

12. Скворцова В.В., Наволокин Н.А. Патоморфоз саркомы s45 при внутримышечном введении флавоноидсодержащего экстракта лабораторным крысам. //Бюллетень медицинских интернет-конференций. 2013. Т. 3. № 2. С. 258.

13. Полуконова Н.В.,  Наволокин Н.А.,  Райкова С. В.и др., Противовоспалительная, жаропонижающая и антимикробная активность флаваноидсодержащего экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.) //Экспериментальная и клиническая фармакология. 2015. Т.78. №1. С. 34-38.

14. Наволокин Н.А., Павлова А.В. Морфологические изменения в мышцах у лабораторных крыс и определение токсичности при введении экстракта аврана // Бюллетень медицинских интернет-конференций. 2012. Т. 2. № 2. С. 82.    

15. Байтман Т.П., Наволокин Н.А., Влияние экстракта аврана лекарственного на лабораторных животных с перевитой саркомой S-45. // Бюллетень медицинских интернет-конференций. 2013. Т.3. - №2. С. 374.

16. Полуконова Н.В., Дурнова Н.А., Курчатова М.Н. и др. Химический анализ и способ получения новой билогически активной композиции из травы аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.) Х//имия растительного сырья. 2013. №4. С.165–173.

17. Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Тычина С.А., Корчаков Н.В. Изменения лейкоцитарной формулы, красного костного мозга и опухоли лабораторных крыс с перевитой саркомой-45 при введении экстрактов аврана лекарственного, бессмертника песчаного, кукурузы антациановой. // Саратовский научно-медицинский журнал. 2015. Т. 11. № 3. С. 328-332.

18. Navolokin N.A., Polukonova N.V., Maslyakova G.N. etc. Effect of extracts of gratiola officinalis and zea mays on the tumor and the morphology of the internal organs of rats with trasplanted liver cancer. //Russian Open Medical Journal, 2012. V.2. №1. P.0203.

19. Полуконова А.В., Наволокин Н.А., Бибикова О.А. Цитотоксическая активность in vitro экстракта аврана на культуре клеток почек эмбрионов свиньи, зараженных онковирусом. // Бюллетень медицинских интернет-конференций. 2013. Т. 3. № 2. С. 375.

20. Наволокин Н.А., Полуконова А.В., Бибикова О.А. и др. Цитоморфологические изменения в культуре клеток почки эмбриона свиньи при воздействии экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.) //Фундаментальные исследования. 2014. №10. C.1369-1374.

21. Polukonova N.V., Kurchatova M.N., Navolokin N.A., et al. A new extraction method of bioflavanoids from poisonous plant (Gratiola officinalis l.). Russian Open Medical Journal. 2014. V.3. №3. P.304.

Таблицы

Таблица 1. Динамика роста музейного штамма M. tuberculosis под действием экстракта аврана лекарственного

Повтор-ность

Дни наблюдений

7 день

10 день

17 день

28 день

Титр МКБ

50

x107

500

x107

50

x107

500

x107

50x

107

500

x107

50

x107

500

x107

1

Контроль

-

-

+

++

++

+++

+++

+++

Экстракт аврана

-

-

-

-

-

-

-

-

2

Контроль

-

++

++

+++

+++

+++

+++

+++

Экстракт аврана

-

-

-

+

(4КОЕ)

-

+

(4КОЕ)

-

+

(18КОЕ)

Примечание: (1+) – 1-20 КОЕ – скудный рост МБТ; (2+) – 21-100 КОЕ – умеренный рост МБТ; (3+) – более 100 КОЕ – обильный рост МБТ

Таблица 2. Результаты ПЦР-анализа клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis

№ тестируемой культуры

Устойчивость к рифампицину

Устойчивость к изониазиду

Кодон гена rpoB

Аминокислотная замена

Ген

Кодон

Аминокислотная замена

           1

Обнаружена ДНК МБТ (фрагмент IS6110). Ген rpoB не содержит мутаций, ответственных за устойчивость к рифампицину. Гены katG, inhA, ahpC не содержат мутаций, ответственных за устойчивость к изониазиду. 

           2

             531

Ser→Leu

katG

315

Ser→Thr(1)

Таблица 3. Результаты анализа противотуберкулезной активности экстракта аврана лекарственного на клинических штаммах

Концентрация экстракта в среде (мг/мл)

Учет результата

№ тестируемой культуры

Чувствительный штамм

Штамм с МЛУ

число КОЕ* в контроле

95%

95%

212.5  

число КОЕ

-

-

результат

S S

106.3              

число КОЕ

-

-

результат

S S

53.1    

число КОЕ

-

-

результат

S S

26.6    

число КОЕ

-

18

результат

S

S/R

13.3    

число КОЕ

2

35

результат

S

R

6.6

число КОЕ

30

80%

результат

R

R

Примечание: *Число КОЕ (колонию образующая единица) указано, если его можно подсчитать. При большом числе КОЕ, не поддающемся подсчету, указана приблизительная доля (%) поверхности питательной среды с ростом МБТ.

Результат: S – штамм чувствителен, R – штамм устойчив.

0
Ваша оценка: Нет



Оптимальный хостинг для Drupal, Wordpress, Joomla, Битрикс и других CMS, быстрые и надежные сервера, круглосуточная техподдержка Яндекс.Метрика