Skip to Content

Биоцидные свойства суспензий наночастиц металлов и их оксидов

ID: 2017-06-2076-A-14408
Оригинальная статья
Студент

Резюме

Появление новых инфекционных заболеваний и развитие лекарственной устойчивости у патогенных бактерий и грибов, увеличивается с угрожающей скоростью и вызывает серьезную озабоченность.  Таким образом, необходимо разработать новые стратегии и синтезировать новые антимикробные агенты, которые можно создать доступным, быстрым и экологичным способом. 

Благодаря высокой биологической активности, относительно низкой себестоимости и экологической безопасности наночастицы меди и цинка являются весьма перспективными для разработки антибактериальных средств.

Появление новых инфекционных заболеваний и развитие лекарственной устойчивости у патогенных бактерий и грибов, увеличивается с угрожающей скоростью и вызывает серьезную озабоченность.  Таким образом, необходимо разработать новые стратегии и синтезировать новые антимикробные агенты, которые можно создать доступным, быстрым и экологичным способом. 

Благодаря высокой биологической активности, относительно низкой себестоимости и экологической безопасности наночастицы меди и цинка являются весьма перспективными для разработки антибактериальных средств.

Ключевые слова

антибактериальные свойства, наночастицы металлов

Введение

Одним из перспективных направлений применения металлических и оксидных наночастиц является создание нового класса альтернативных антимикробных препаратов. Необходимость поиска таких биоцидных средств диктуется быстрым формированием устойчивости микроорганизмов к антибиотикам, рассматриваемая как серьезная угроза общественному здравоохранению.

В настоящее время существует большое число работ направленных на изучение антибактериальных свойств наночастиц металлов и их оксидов, обладающих широким спектром антибактериального действия и не вызывающих развития резистентности микроорганизмов.

Благодаря высокой биологической активности, относительно низкой себестоимости и экологической безопасности наночастицы меди и цинка являются весьма перспективными для разработки антибактериальных средств.

Цель

Целью работы являлось исследование антибактериальных свойств суспензий наночастиц меди и оксида цинка в зависимости от типа и размера частиц, концентрации, дисперсионной среды и времени хранения коллоидных растворов, по отношению к бактериям E. Coli M-17.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы конкретные задачи:
1. Исследовать влияние типа и размера частиц на антибактериальные свойства коллоидных растворов наночастиц меди и оксида цинка.
2. Установить наиболее эффективные концентрации частиц в коллоидных растворах, при которых антибактериальные свойства наночастиц были бы максимальны.
3. Установить влияние дисперсионной среды на бактерицидные свойства наночастиц меди и оксида цинка
4. Изучить влияние времени хранения суспензий наночастиц меди и оксида цинка на их антибактериальные свойства.

Материал и методы

В работе исследовались наночастицы меди и оксида цинка разных размеров. Наночастицы меди были получены методом электрического взрыва проводников в среде аргона с добавкой водорода (10% об.) при давлении 1,52·105Па, зарядном напряжении емкостного накопителя 24 кВ (диаметр проводника 0,3 мм, длина – 75 мм). Для сохранения устойчивости меди проводили пассивирование нанопорошка путем медленного окисления воздухом (производитель – ООО «Передовые порошковые технологии», Томск, Россия). Согласно производителю среднеарифметический размер частиц порошков составлял 50 нм (Cu1, удельная поверхность 12 м2/г) и 100 нм (Cu2, удельная поверхность 6.8 м2/г), форма частиц – сферическая.

Наночастицы оксида цинка получены методом химического осаждения. Наночастицы с заявленным размером 20 нм (ZnO1, удельная поверхность 50 м2/г) произведены компанией Nanostructured&AmorphousMaterials, Inc. (USA), частицы 100 нм (ZnO2) получены в НИТУ «МИСиС» (Россия).

Суспензии наночастиц готовили на основе дистиллированной воды
(рН=7, ±0,2,) и 9 %-ного раствора NaCl (рН 7, ±0,2). Навески нанопорошков
(10 мг) взвешивали при помощи аналитических весов ViBRAHT (ShinkoDenshi, Japan, (точность ±0,0001 г)) и всыпали в предварительно приготовленную среду для диспергирования и перемешивали стеклянной палочкой в течении 20 секунд. После перемешивания, суспензии обрабатывали в ультразвуковой ванне UltrasonicCleanerCD-4800 (Codyson, Китай) в течение 40 секунд (70 W, 44 Hz, объём – 1,4 л). Исходная концентрация частиц во всех растворах составляла 10 мг/л, из которой путем разбавления готовили суспензии с концентрацией меди: 1, 0.1, 0.01, и 0.001 мг/л дистиллированной водой или физиологическим раствором, соответственно.

Посуда для хранения проб и биотестирования промывалась смесью бихромата калия и серной кислоты (хромовой смесью). Стенки посуды осторожно смачивали хромовой смесью и оставляли на 2-3 часа, затем тщательно промывали водопроводной водой, нейтрализовали раствором пищевой соды и 3-4 раза промывали дистиллированной водой.

Для анализа токсических свойств использовали свежеприготовленные суспензии (не более 1 часа выдерживания) и суспензии со сроком хранения не более 24 часов.

Для сравнения использовались растворы, содержащие ионы Cu2+ и Zn2+. Растворы готовились на основе дистиллированной воды (рН=7, ±0,2) проводимость 0,2 мкС и физиологического раствора (рН=7, ±0,2), путем растворения двуводной соли хорида меди (CuCl2 * H2O, GOST 4167-74, RussianFederation) и цинка хлористого (ZnCl2, ГОСТ 4529-78, Россия).

В качестве тест-объекта использовался препарат лиофилизированных бактерий Е. Coli M-17 серии «Эколюм». Биосенсор «Эколюм» представляет собой лиофилизированные культуры люминесцентных бактерий, содержащиеся в среде инертных газов в специальных стеклянных флаконах. Производится в Российской Федерации согласно ТУ 2639-236-00209792-01.

Особенностью биосенсора является его способность изменять интенсивность спонтанной биолюминесценции при наличии в анализируемых пробах токсических веществ различной химической природы. Биосенсор обладает очень широким спектром действия на разнообразные химические соединения: тяжелые металлы, пестициды, фенолы, углеводороды и т. д.

Биосенсор имеет свидетельство о метрологической аттестации (4/7-93).

Для исследования токсичности растворов наночастиц меди и оксида цинка была использована биолюминесцентная методика, применяемая  для микробиологической и молекулярно-генетической оценки воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза [1-5].

Метод основан на определении изменения интенсивности биолюминесценции генно-инженерного штамма фотобактерий E. Coli M-17 при воздействии наночастиц, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Критерием токсического действия является изменение интенсивности биолюминесценции тест-объекта в исследуемой пробе по сравнению с контрольной, не содержащей токсических веществ. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.

Токсическое действие исследуемой пробы наноматериала на бактерии определяется по ингибированию их биолюминесценции за 30-ти минутный период экспозиции. Количественная оценка параметра тест-реакции выражается в виде индекса токсичности Т, безразмерной величины, рассчитываемой по формуле: Т=100 (Iо - I)/ Iо, где Iо и I - интенсивность свечения контроля и опыта, соответственно, при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с тест-объектом.

Методика допускает три пороговых уровня индекса токсичности:

1) допустимая степень: индекс токсичности Т  от 0 до 20;

2) средняя степень: индекс Т равен от  20 до 50;

3) высокая степень: индекс токсичности Т равен или более 50.

Отрицательные значения индекса токсичности рассматриваются как отсутствие токсичности.

При определении индекса токсичности проводилось параллельное измерение контрольных и опытных проб. Для большей достоверности данных число повторов опытной пробы было увеличено до 5 измерений.

Результат токсикологического анализа – индекс токсичности – представляется в виде: x̅± σ. x̅– среднее арифметическое определение индекса токсичности для n повторов,
σ – среднее квадратичное отклонение, которые определяют по общепринятым формулам, представленным в презентации (слайд 1).

Измерения проводились на специализированном люминометре “Биотокс -10” (Россия). Первый этап тестирования проводился сразу после приготовления растворов, второй – через 24 часа. рН растворов фиксировалась перед каждым измерением при помощи цифрового рН-метра «рН-2005» SELECTA (Barcelona, Spain).

Результаты

Экспериментальные данные, полученные в работе, после соответствующей статистической обработки представлены в виде совокупностей графиков, изображенных в презентации (слайды 2 и 3). Графики отражают зависимости проявляемых антибактериальных свойств от типа, размера частиц, времени хранения суспензий, типа дисперсионной среды, а так же концентрации наночастиц в растворах. Полученную совокупность графиков целесообразно разделить на 4 типа, соответствующих типу и размеру частиц, дисперсионной среде, концентрации растворов и времени хранения суспензий.

На слайде 2 приведены зависимости антибактериальных свойств меди от размера частиц и времени хранения их суспензий в водной среде. Наночастицы Cu1 в свежих суспензиях продемонстрировали аномальную токсичность. В водной среде антибактериальный эффект наблюдался при минимальной из исследуемых концентраций, затем исчезал, и вновь появлялся при максимальной концентрации. В среде физиологического раствора максимальный антибактериальный эффект наблюдался при средней (0,1 мг/л) и максимальной (10 мг/л) концентрациях, используемых в данной работе.

Наночастицы Cu2 не проявили биоцидного эффекта в водных суспензиях, однако в среде физиологического раствора наблюдалась средняя степень токсичности при максимальной из исследуемых концентраций.

Данные по частицам оксида цинка представлены на слайде 3. Видно, что в водной среде, при любой концентрации, наиболее высокая степень токсичности наблюдается у образца ZnO1. В физиологическом растворе, напротив, ZnO2 занял лидирующее место.

Таким образом наибольшей антибактериальной способностью обладают суспензии наночастиц оксида цинка. При этом для водных растворов большей степенью токсичности обладают наночастицы ZnO размером 20 нм, а для физиологических растворов – наночастицы ZnO размером 100 нм.

На 2 и 3 слайдах изображены графики, отражающие зависимость антибактериальных свойств от концентрации растворов наночастиц меди и оксида цинка. Полученные данные в целом свидетельствуют о том, что самую высокую степень токсичности по отношению к бактериям E. Coli M-17 проявляют растворы с самой высокой концентрацией – 10 мг/л, в независимости от размера частиц и дисперсионной среды. Исключением является свежеприготовленный образец Cu1 в физиологическом растворе (Слайд 2, Рис.2), проявивший высшую степень токсичности при концентрации 0.1 мг/л.

Полученные данные свидетельствуют о том, что наночастицы оксида цинка в целом обладают «классическими» биоцидными свойствами, т.е. с увеличением концентрации антибактериальный эффект возрастает. Таким образом оптимальной концентрацией наночастиц оксида цинка, при которой антибактериальные свойства частиц были бы максимальны является концентрация 10 мг/л. В случае с медью, зафиксированы «аномальные» антибактериальные эффекты, проявляющиеся в нелинейной зависимости токсичности от концентрации, что необходимо учитывать при разработке антибактериальных препаратов на основе наночастиц меди. Так, для образца Cu2, оптимальной является концентрация 10 мг/л, для меди Cu1 (50 нм) в свежеприготовленном физиологическом растворе – 0,1 мг/л.

На Рис. 6 и 7 изображены графики зависимости антибактериальной активности наночастиц Cu1 и Cu2 от дисперсионной среды суспензий частиц. Полученные данные свидетельствуют о том, что дисперсионная среда на образец Cu1 (24 часа) оказала слабое воздействие. При концентрации 10 мг/л, в водном растворе индекс токсичности образца – 0,91, в физиологическом растворе – 1,82. Суспензии наночастиц Cu2 (24 часа) в физиологическом растворе при концентрации 10 мг/л увеличели свой индекс токсичности до уровня 48 (средняя степень токсичности), в то время как в водном растворе индекс токсичности – 0,47.

Наночастицы ZnO1 и ZnO2 (24 часа), при концентрации 10 мг/л, в физиологических растворах так же показали увеличение индекса токсичности (Слайд 3). Так у образца ZnO1 (24 часа) в водной среде высший индекс токсичности – 90,1, в физиологическом же растворе – 90,4. ZnO2 имеет индекс токсичности в водной среде 64,2, в физиологическом растворе – 95,3.

Обсуждение

Таким образом, можно заключить, что дисперсионная среда суспензий наночастиц металлов и оксидов металлов влияет на их антибактериальные свойства. Степень токсичности суспензий наночастиц увеличивается в физиологическом растворе.

С течением времени большинство растворов теряли антибактериальные свойства, за исключением суспензий Cu2 в среде физиологического раствора (Слайды 2 и 3). Для свежих водных растворов цинка отмечен существенный бактерицидный эффект при всех исследуемых концентрациях, однако по прошествии суток токсическое действие оказывали только максимальные концентрации – 1 и 10 мг/л.

Из приведенных данных следует, что время хранения не сильно сказывается на антибактериальных свойствах суспензий наночастиц металлов и оксидов металлов. Тем не менее, у свежеприготовленных растворов степень токсичности выше. 

Заключение

1.                Наибольшую антибактериальную активность проявляют наночастицы оксида цинка. При этом для водных растворов большей степенью токсичности обладают наночастицы ZnO размером 20 нм, а для физиологических растворов – наночастицы ZnO размером 100 нм.

2.                Наночастицы оксида цинка в целом обладают «классическими» биоцидными свойствами, т.е. с увеличением концентрации антибактериальный эффект возрастает. В случае с медью, зафиксированы «аномальные» антибактериальные эффекты, проявляющиеся в нелинейной зависимости токсичности от концентрации, что необходимо учитывать при разработке антибактериальных препаратов на основе наночастиц меди.

3.                 Дисперсионная среда суспензий наночастиц металлов и оксидов металлов влияет на их антибактериальные свойства. Степень токсичности суспензий наночастиц выше в физиологическом растворе.

4.                 Время хранения суспензий оказывает влияние на антибактериальные свойства наночастиц металлов и оксидов металлов. У свежеприготовленных растворов степень токсичности выше. 

Литература

1.    Tamayo L. A., Zapata P. A., Rabagliati F. M., Azócar M. I., Muñoz L. A., Zhou X., Thompson G. E., Páez M. A. Antibacterial and non-cytotoxic effect of nanocomposites based in polyethylene and copper nanoparticles // Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 2015 Mar;26(3):129. doi: 10.1007/s10856-015-5475-6. Epub 2015 Feb 19.

2.    Shankar S., Teng X., Rhim J. W. Properties and characterization of agar/CuNPbionanocomposite films prepared with different copper salts and reducing agents // Carbohydrate Polymers. 2014 Dec 19 ; 114: 484-92. doi: 10.1016/j.carbpol.2014.08.036. Epub 2014 Aug 27.

3.    Gunawan C., Teoh W. Y., Marquis C. P., Amal R. Cytotoxic origin of copper (II) oxide nanoparticles: comparative studies with micron-sized particles, leachate, and metal salts // ACS Nano. – 2011. – Vo.5. – P.7214–7225.

4.    Midander K., Wallinder I.O., Leygraf C. In vitro studies of copper release from powder particles in synthetic biological media // Environmental Pollution. 2007. Vo.145. P.51-59.

5.    Hostynek J. J., Maibach H. I. Copper hypersensitivity: dermatologic aspects-an overview.  Reviews on Environmental Health // 2003. Vo.18(3). P.153-183.

0
Ваша оценка: Нет



Оптимальный хостинг для Drupal, Wordpress, Joomla, Битрикс и других CMS, быстрые и надежные сервера, круглосуточная техподдержка Яндекс.Метрика