Проведена оценка цитогенетического действия диоксидина на клетки меристемы корешков лука с помощью Allium test. Учитывалась динамика роста корней Allium cepa, а также показатель митозмодифицирующего действия – митотический индекс. Установлено, что раствор диоксидина в диапазоне концентрациий 10 мг/л – 100 мг/л снижает митотическую активность тканей по сравнению с контролем и, следовательно, обладает митотоксической активностью.
Проведена оценка цитогенетического действия диоксидина на клетки меристемы корешков лука с помощью Allium test. Учитывалась динамика роста корней Allium cepa, а также показатель митозмодифицирующего действия – митотический индекс. Установлено, что раствор диоксидина в диапазоне концентрациий 10 мг/л – 100 мг/л снижает митотическую активность тканей по сравнению с контролем и, следовательно, обладает митотоксической активностью.
Научный руководитель: зав. кафедрой, доцент, д. б. н., Дурнова Н.А.
В настоящее время все большее внимание уделяется растительным тест-системам как средствам оценки уровня влияния тех или иных факторов на живые организмы [1, 2, 3]. Одной из наиболее распространенных и простых в освоении тест-систем является Allium test [1,4], который рекомендован экспертами ВОЗ как стандарт в цитогенетическом мониторинге окружающей среды [2]. Allium test используется для оценки цитогенетического действия химических и физических факторов с использованием Allium cepa – Лука репчатого (сорт Штутгартен ризен) и позволяет выявить митотоксическое действие какого-либо фактора, сказывающееся на скорости деления клеток меристемы корня через митотический индекс [5]. По сравнению с другими растительными тест-системами Allium test имеет ряд преимуществ, таких как высокая скорость оценки, доступность материалов и хорошая корреляция с результатами исследований на других эукариотических организмах (например, с результатами тестов на клетках млекопитающих и человека уровень корреляции достигает 82 %) [2, 4].
Данный тест может быть использован для оценки цитогенетического действия лекарственных препаратов, например, с помощью Allium test проводились исследования метотрексата [6]. Диоксидин – антибактериальный препарат широкого спектра, который действует на штаммы микроорганизмов, устойчивых к другим антибактериальным лекарственным средствам, но при этом до настоящего времени проводятся активные исследования не только по анализу чувствительности разных штаммов микроорганизмов по отношению к его воздействию [7], но и по изучению влияния диоксидина на эукариотические клетки [3]. Установленные цитостатические свойства этого препарата позволили рекомендовать его в качестве противоопухолевого средства [8].
Изучить цитогенетическую активность диоксидина (растворы разных концентраций) с использованием Allium test.
Для оценки цитогенетического действия раствора диоксидина с помощью Allium test использовали луковицы Allium cepa, помещали в стаканчики объемом 100 мл с растворами диоксидина разных концентраций (10 мг/л, 20 мг/л, 30 мг/л, 40 мг/л, 50 мг/л, 60 мг/л, 70 мг/л, 80 мг/л, 90 мг/л, 100 мг/л) и проращивали в течение 3 суток. Одновременно исследовалась и контрольная группа с дистиллированной водой.
На первом этапе анализа митотической активности проводили первичный скрининг-тест, который заключался в измерении динамики роста корешков. На каждой луковице на 3-й день срезали по 5 самых длинных корешков, измеряли их длину линейкой и рассчитывали средний прирост для каждой луковицы.
Приготовление микропрепаратов меристем корешков Allium cepa проводили по стандартной методике [9] с модификациями: окрашивание корешков в ацетогематоксилине было заменено на окрашивание в этилорсеине вместо жидкости Гойера при помещении на предметное стекло использовалась молочная кислота, что позволило ускорить окрашивание микропрепаратов.
При анализе микропрепаратов использовали микроскоп «Микромед Р-1» и видеоокуляр CMOS EVS-5,17 mp. На каждом микропрепарате при увеличении 16×40 просматривали не менее 1000 клеток, среди них подсчитывали количество клеток на разных стадиях митоза и число клеток на стадии интерфазы [9,10, 11] (рис. 1).
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ LibreofficeCalc.
Наибольший прирост корешков Allium cepa был получен в контрольном варианте опыта, однако в эксперименте наблюдалась неравномерная динамика прироста, и статистическая обработка полученных данных не показала их достоверность (табл.1, рис.2), поэтому для дальнейшего изучения митотоксических эффектов диоксидина анализировали микропрепараты корневых меристемы Allium cepa. Анализ воздействия проводили в сравнении с контролем. Результаты показали отрицательную прямую зависимость значений митотического индекса от концентрации раствора диоксидина, что свидетельствует о подавлении митотической активности клеток. По результатам статистической обработки данных различия достоверны (по критерию Стьюдента).
Установлено, что наименьшее подавление митотической активности клеток меристемы лука наблюдается при концентрации раствора диоксидина 10 мг/л, наибольшее митотоксическое воздействие – при концентрации 100 мг/л (табл.2, рис.3).
Исследование митотоксического воздействия раствора диоксидина, проведенное нами с использованием Allium test, показало, что значения митотического индекса между контрольной группой и экспериментальными выборками достоверно отличались для проанализированных концентраций диоксидина, что свидетельствует об угнетении митотической активности под влиянием этого препарата.
1. Буданцев А.Ю. Измерение динамики роста корней при использовании Аллиум-теста // Биологические науки / Фундаментальные исследования. – 2014. – № 6. – С. 1393-1396
2. Песня Д.С., Романовский А.В., Прохорова И.М. Исследование токсического и генотоксических эффектов синтетических прищевых красителей методом Alliumtest // Ярославский педагогический вестник. – 2012. – №3. – Том III (Естественные науки). – С.86-93
3. Шкарупа В.М., БирилякI.P. Мутагенез, iндукований дiоксидином в Allium-тестi // Цитология и генетика. – 2006. – 40, №5. – С.31-35
4. Fiskesjо G. The Allium Test as a standard in environmental monitoring // Hereditas. – 1985. – Т. 102. – С. 99-112
5. Влияние электромагнитных колебаний различных частот на деление клеток в меристеме корня Allium cepa / А.Ю.Лаврский, И.А.Лебединский, А.Ф.Кузаев [и др.] // Международный научно-исследовательский журнал. – 2013. – № 5-1 (12). – С. 43-45.
6. Буданцев А.Ю., Кутышенко В. П. Действие метотрексата на первичный рост корней Alliumcepa // Фундаментальные исследования. – 2012. - №11. – С. 833-836
7. Падейская Е.Н. Антибактериальный препарат диоксидин: особенности биологического действия и значение в терапии различных форм гнойной ифекции // Инфекции и антимикробная терапия. – 2001. – Том 3, №5. - С. 150-155
8. Применение диоксидина в качестве противоопухолевого средства: пат. RU 2325162 C1 Рос. Федерация: МПК51 А61К 31/498, А61Р 35/00 / Одарюк Т.С., Ревельский И.А., Воробьев Г.И., Киселевский М.В., Шелыгин Ю.А., Расулов А.О., Полезина А.С.; заявитель т патентообладатель Одарюк Т.С., Ревельский И.А., Воробьев Г.И., Киселевский М.В., Шелыгин Ю.А., Расулов А.О., Полезина А.С. – № 2006139219/14; заявл. 08.11.2006; опубл. 27.05.2008, Бюл. №15
9. Калаев В Н. Цитогенетический мониторинг: методы оценки загрязнения окружающей среды и состояния генетического аппарата организма / В.Н. Калаев, С.С. Карпова; Воронежский государственный университет. – Воронеж, 2004. – 80 с.
10. Калаев В.Н. Микроядерный тест буккального эпителия ротовой полости человека: монография / В.Н. Калаев, М.С. Нечаева, Е.А. Калаева; Воронежский государственный университет. – Воронеж: Издательский дом ВГУ, 2016. – 136 с.
11. Сальников В.Н., Полухина Н.В., Шереметьева А.С., Левина В.А., Егерева М.А. Применение микроядерного теста для оценки влияния зубных протезов на генетический аппарат человека // Клинические и теоретические аспекты современной медицины. 2011. С. 103-104.
Таблица 1. Зависимость прироста корешков от концентрации
С, мг/л |
Прирост 1 серия, мм |
Прирост 2 серия, мм |
Прирост сред., мм |
0 |
6,60 |
9,00 |
7,80 ± 1,16 |
10 |
0,60 |
0,40 |
0,50 ± 0,10 |
20 |
0,90 |
2,40 |
1,65 ± 0,72 |
30 |
2,80 |
3,00 |
2,90 ± 0,10 |
40 |
0,20 |
2,00 |
1,10 ± 0,87 |
50 |
4,20 |
7,80 |
6,00 ± 1,73 |
60 |
2,20 |
5,20 |
3,70 ± 1,45 |
70 |
1,70 |
2,90 |
2,30 ± 0,58 |
80 |
0,20 |
0,10 |
0,15 ± 0,05 |
90 |
0,40 |
0,10 |
0,25 ± 0,14 |
100 |
0,10 |
0,00 |
0,05 ± 0,05 |
Таблица 2. Зависимость митотического индекса MI от концентрации
С,мг/л |
MI 1,% |
MI 2,% |
MI cp,% |
0 |
47,14 |
46,80 |
46,97 ± 0,16 |
10 |
35,10 |
37,60 |
36,35 ± 1,21 |
20 |
36,80 |
34,30 |
35,55 ± 1,21 |
30 |
30,00 |
29,90 |
29,95 ± 0,05 |
40 |
37,03 |
26,16 |
31,59± 5,24 |
50 |
31,53 |
23,75 |
27,64 ± 3,75 |
60 |
12,34 |
21,55 |
16,95 ± 4,44 |
70 |
13,10 |
19,25 |
16,18± 2,96 |
80 |
15,22 |
15,20 |
15,21 ± 0,01 |
90 |
14,08 |
11,94 |
13,012± 1,03 |
100 |
11,83 |
12,73 |
12,28± 0,43 |