.
Введение
Клинические проявления СКВ разнообразны, поэтому большое значение имеет поиск потенциальных биомаркеров, как отражающих риск вовлечения в патологический процесс различных органов, так и являющихся чувствительными индикаторами активности заболевания [4,7].
Поражение почек при СКВ является одним из наиболее серьезных висцеритов, определяющих тяжесть заболевания и раннюю инвалидизацию больных. Клинические проявления волчаночной нефропатии встречаются в 50-70% всех случаев СКВ, тогда как морфологические признаки нефропатии обнаруживаются у 100% больных. В последнее десятилетие возрос интерес нефрологов к изучению биологических маркеров воспаления и повреждения почек: цитокинов, острофазных белков, факторов ангио- и фиброгенеза, играющих важную роль в формировании нефросклероза[1,6,8,10]. Наибольшую диагностическую значимость имеют результаты неинвазивного метода определения данных маркеров в моче [2]. Результаты этих исследований могут использоваться для выявления ранних стадий хронической болезни почек (ХБП), а также своевременного проведения адекватной терапии. В настоящее время цитокины, острофазные белки, факторы ангио- и фиброгенеза у пациентов с СКВ мало изучены.
Целью настоящей работы являлось изучение взаимосвязи изменения уровня факторов роста и цитокинов в сыворотке крови и мочебольных СКВ сразличным течением заболевания и активностью воспалительного процесса.
Материалы и методы
Обследовано 40 пациентов с достоверным диагнозом СКВ, находившихся на обследовании и лечении в ГУЗ Областная клиническая больница (г. Саратов) в период с января по май 2013 года. Диагноз устанавливался при наличии четырех и более критериев согласно данным Американской ревматологической ассоциации (АРА, 1982). Группа исследуемых больных состояла из 39 женщин и 1 мужчины. Средний возраст пациентов составил 42,15±14,44 года. Возраст дебюта заболевания составил 31,5±15,51 год, длительность заболевания – 11,2±10 лет. Большинство пациентов имели хроническое течение – 24 (60%) больных, подострое выявлено у 9 (22,5%) больных, острое – у 7 (17,5%) пациентов. I степень активности заболевания диагностирована у 25 пациентов (62,5%), II – у 14 больных (35%) и III – у 1 больного (2,5%).
Кожные изменения (эритема по типу «бабочки», другие виды эритемы, дискоидные высыпания) зафиксированы у 19 (47,5%) пациентов; аллопеция – у 10 больных (2,5%), хейлит – у 6 пациентов (15%), стоматит – у 7 больных (17,5%), серозиты (плевриты, перикардиты) выявлены у 13 (32,5%) больных; артрит – у 28 больных (70%), синдром Рейно – у 9 пациентов (22,5%), антифосфолипидный синдром (АФС) установлен у 10 больных (25%), поражение почек в виде гломерулонефрита – у 16 (40%) пациентов, гепатоспленомегалия – у 9 (22,5%) больных, поражение сердца в виде миокардита выявлено у 4 пациентов (10%), эндокардита – у 1 больного (2,5%).
Для сравнительной оценки маркеров воспаления и повреждения почек в сыворотке крови и моче была обследована группа из 20 практически здоровых доноров, не имеющих патологии сердечно-сосудистой и мочевыделительной систем, сопоставимых по полу, возрасту, индексу массы тела, уровню артериального давления с исследуемой группой больных СКВ (p>0,05).
Проводился сбор анамнестических данных, объективное обследование пациентов, выполнялся комплекс общепринятых лабораторных исследований. Для количественного анализа биомаркеров взятие крови у пациентов исследуемой группы и пациентов группы сравнения проводили натощак, в утренние часы из кубитальной вены с использованием систем для забора крови "Vacuette" с активатором свертывания крови и разделительным гелем. Первую порцию утренней мочи, в объеме не менее 100 мл, собирали в специальные стаканы с крышками. Предварительно в емкость для забора мочи вносили 20 мкл раствора "ProClin 300" ("SUPELCO", США). Аликвоты сыворотки крови и мочи разливали в пробирки с крышками типа "Eppendorf" объемом 2 мл и хранили до проведения исследования при температуре -25 ºС.
Концентрацию интерлейкинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10), фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-α), маркера активности воспалительного процесса моноцитарного хемоаттрактанта-1 (МСР-1), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF - Vascular endothelial growth factor) в сыворотке крови и моче обследуемых определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), используя соответствующие наборы реагентов ЗАО "Вектор-Бест" (Новосибирск). Исследование всех этих биомаркеров у больных СКВ проводили однократно. Для оценки функционального состояния почек у всех пациентов определялся креатинин сыворотки крови по методу Яффе на биохимическом анализаторе «Hitachi 912» с использованием реагентов фирмы «DiaSys», исследовался общий анализ мочи, у части больных изучалась суточная протеинурия, выполнялись проба Нечипоренко, УЗИ почек. Оценивались особенности патологии сердечно-сосудистой и мочевыделительной систем.
Статистическая обработка осуществлялась с использованием программ Microsoft Office Exсel 2007 (Microsoft Corp., США) и Statistica 8.0 (StatSoft Inc., США). Характер распределения данных оценивали графическим методом с использованием критерия Шапиро–Уилка. Описание признаков, имеющих нормальное распределение, представлено в виде M±SD, где М – среднее арифметическое, SD – стандартное отклонение; для признаков с распределением, отличным от нормального, результаты представлены в виде Ме [Q1; Q3], где Me – медиана, Q1 и Q3 – первый и третий квартили. Для обработки данных с распределением, отличным от нормального, применяли непараметрические методы: критерий Манна – Уитни, критерий χ2 с поправкой Йетса. Для оценки взаимосвязи между отдельными показателями использовался корреляционный анализ с расчетом непараметрического коэффициента корреляции Спирмена. При сравнении более чем двух независимых группировок применяли методы дисперсионного анализа: параметрический дисперсионный анализ для нормально распределенных данных и ранговый анализ вариаций по Краскелу – Уоллису для данных с распределением, отличным от нормального. Различия между показателями считали значимыми при p<0,05.
Результаты
Нами установлено статистически значимое повышение концентрации VEGF (р=0,001), МСР-1 (р=0,001), ИЛ-6 (р=0,01) в сыворотке крови больных СКВ по сравнению с лицами группы сравнения. Содержание ИЛ-8 в сыворотке крови пациентов с СКВ имело тенденцию к повышению по сравнению с лицами группы сравнения, однако значимых различий не достигло (р>0,05). Концентрации ИЛ-1β, ИЛ-10 и ФНО-α в сыворотке крови лиц группы сравнения оказались значимо выше, нежели у больных СКВ, результаты представлены в таблицах 1 и 2.
В моче пациентов с СКВ установлено существенное повышение уровня VEGF (р=0,001), ИЛ-6 (р=0,001) и ИЛ-8 (р=0,01) по сравнению с лицами группы сравнения. Концентрация МСР-1 в моче больных СКВ имела тенденцию к повышению, однако значимых различий с лицами группы сравнения не достигла (р>0,05). Концентрации ИЛ-1β, ИЛ-10 и ФНО-α в моче пациентов с СКВ оказались значимо ниже, нежели в пробах мочи у лиц группы сравнения.
Изучены уровни биомаркеров в сыворотке крови и моче больных с различным течением СКВ, результаты представлены в таблице 3.
При сравнении концентрации биомаркеров в сыворотке крови пациентов с различным течением СКВ выявлены статистически значимые различия в содержании VEGF, MCP-1, ИЛ-6, ИЛ-8 по сравнению с уровнем биомаркеров у лиц группы сравнения (р<0,05). В моче обнаружены статистически значимые различия в концентрации VEGF, ИЛ-6, ИЛ-8 у пациентов с острым, подострым и хроническим течением СКВ по сравнению с аналогичными маркерами у лиц группы сравнения (р<0,05). Установлено существенное повышение концентрации МСР-1 в моче у пациентов с подострым течением заболевания (р<0,05).
Исследованы концентрации биомаркеров в сыворотке крови и пробах мочи у пациентов с первой и второй степенями активности СКВ (табл. 4).
В исследуемых пробах крови пациентов с I-ой степенью активности СКВ по сравнению с лицами группы сравнения обнаружено значимое повышение уровней концентрации VEGF, MCP-1, ИЛ-6, ИЛ-8 (p<0,05); в пробах мочи отмечено значимое увеличение концентрации этих хемокинов, за исключением МСР-1 (р>0,05). У пациентов со II-ой степенью активности в пробах сыворотки крови и мочи значимо повышены концентрации VEGF и ИЛ-8 (p<0,05) по сравнению с лицами группы сравнения. При этом уровень ИЛ-6 значимо увеличивался только лишь в пробах мочи (p<0,05). Концентрация МСР-1 у пациентов со II-ой степенью активности по сравнению с ее концентрацией у лиц группы сравнения значимо не изменялась ни в пробах крови, ни в пробах мочи (р>0,05).
При сравнении показателей концентрации данных биомаркеров в сыворотке крови и моче между пациентами с первой и второй степенями активности значимых различий не выявлено (р>0,05). Сравнительный анализ концентрации биомаркеров у пациентов с III степенью активности нами не проводился ввиду малой численности пациентов данной группы.
Проведен анализ изменений изучаемых биомаркеров сыворотки крови и мочи у больных СКВ в зависимости от проявлений самого заболевания. Значимое увеличение концентрации VEGF сыворотки крови выявлено при наличии у пациентов стоматита по сравнению с пациентами СКВ, у которых стоматит отсутствовал (422,2 [308,2;874,6] и 210,8 [119,3;347,1] соответственно, р=0,04). При проведении рангового анализа между группами пациентов СКВ с различными гематологическими нарушениями, такими как анемия, тромбоцитопения, лейкопения, нами выявлено значимое изменение концентрации VEGF сыворотки крови (n=40; h=9,6; p=0,0355). VEGF, исследуемый в пробах мочи, значимо выше у пациентов с патологией почек (гломерулонефрит и др.) по сравнению с больными СКВ, у которых патологии почек выявлено не было (292,75 [148,9;446,10] и 182,5 [118,4;245,3] соответственно, р=0,033), однако при мониторинге изучаемого показателя в зависимости от варианта проявления поражения почек значимых изменений нами не выявлено (p>0,05). Концентрация МСР-1 сыворотки крови значимо увеличивалась у пациентов с СКВ при наличии LE-клеток по сравнению с больными, не имеющими в крови данных клеток (876,9 [463,1;1716] и 302,4 [134,2;573,8] соответственно, р=0,0067). Мониторинг концентрации интерлейкинов сыворотки крови и мочи не показал значимых изменений в зависимости от проявлений заболевания.
При проведении корреляционного анализа установлены взаимосвязи между концентрацией ФНО-α и количеством АТ к ДНК (r=0,414, р=0,021); ИЛ-10 и уровнем СРБ (r=0,359, р=0,023), ИЛ-10 и СКФ (r=-0,322; p=0,042); ИЛ-6 сыворотки крови и длительностью заболевания (r=0,350; р=0,027).
Обсуждение
VEGF является одним из полипептидныхбелков, участвующих ввоспалении ирегуляции иммунногоответа, особенно при ревматических заболеваниях. В нашем исследовании данный биомаркер убедительно доказал свое участие в поддержании системного воспалительного процесса и вовлечении в него тубулоинтерстициальной ткани почек у обследуемых пациентов, на что указывает существенное повышение его уровня как в сыворотке крови, так и в пробах мочи у больных СКВ с поражением почек.
Нами не выявлено статистически значимых различий концентраций исследуемых биомаркеров у больных при различном течении заболевания и разной активности воспалительного процесса. Возможно, это связано с тем, что биологические эффекты многих цитокинов, особенно интерлейкинов, имеют высокую степень идентичности, которая создает широкие возможности для компенсации недостаточности дефицита многих медиаторов другими, а также то, что многие цитокины способны взаимодействовать со структурами одних и тех же рецепторных комплексов. Именно это обстоятельство объясняет отсутствие корреляции между содержанием тех или иных цитокинов и клиническими особенностями течения заболевания.
Одновременное нарастание в моче и сыворотке крови содержания МСР-1 и VEGF свидетельствует об активации воспалительного процесса у больных СКВ не только на уровне эпителия мочевыводящих путей, но и на уровне экстрацеллюлярного матрикса почечной паренхимы, то есть о развитии процессов тубулоинтерстициального фиброза и эндотелиальной дисфункции. В настоящее время многими исследователями придается большое значение трансдифференцировке трубчатых эпителиальных клеток в миофибробласты, которые могут активно размножаться и синтезировать вещества внеклеточного матрикса, что приводит к последующей потере функции почек. Учитывая, что моноциты/макрофаги являются основным компонентом инфильтратов почечного интерстиция, можно считать, что нарастание в моче содержания МСР-1 у больных СКВ характеризует тяжесть тубулоинтерстициального повреждения, а подъем уровня VEGF – формирование эндотелиальной дисфункции с последующей деструкцией органной архитектуры.
Уровень ИЛ-6, как провоспалительного цитокина, повышен как в сыворотке крови, так и в моче пациентов с СКВ. В нашем исследовании установлена взаимосвязь ИЛ-6 с длительностью заболевания.
Отсутствие повышения ИЛ-1β, ИЛ-10 и ФНО-α в сыворотке крови и пробах мочи пациентов с СКВ, по-видимому, может быть обусловлено проведением активной иммуносупрессивной терапии, а также длительным течением хронического воспалительного процесса.
Таблица 1.Концентрация цитокинов и факторов ангиогенеза в сыворотке крови у пациентов с СКВ и лиц группы сравнения
Определяемый биомаркер, пг/мл |
Концентрация цитокинов у пациентов с СКВ |
Концентрация цитокинов у лиц группы сравнения |
VEGF |
243,9 [159,1;350,6]* |
45,4 [39,05;60,25] |
МСР-1 |
397,5 [161,7;1118]* |
60,3 [39,2;109,4] |
ФНО-α |
1,01±0,4* |
2,73±1,9 |
ИЛ-1β |
1,39±1,28* |
5,4±4,3 |
ИЛ-6 |
12,15 [2,12;15,7]* |
2,89 [1,53;3,29] |
ИЛ-8 |
5,53 [3,10;10,45] |
6,05 [4,99;9,20] |
ИЛ-10 |
1,25±0,87* |
2,65±1,32 |
Примечание: * - критерий достоверности различий между показателями больных СКВ и лиц группы сравнения;р<0,05.
Таблица 2. Концентрация цитокинов и факторов ангиогенеза в моче у пациентов с СКВ и лиц группы сравнения
Определяемый биомаркер, пг/мл |
Концентрация цитокинов у пациентов с СКВ |
Концентрация цитокинов у лиц группы сравнения |
VEGF |
257,15 [126,15;357,6]* |
33,21 [18,8; 41,0] |
МСР-1 |
313,4 [167,3; 634,5] |
252,6 [156,18;287,6] |
ФНО-α |
1,23±0,24* |
2,6±1,13 |
ИЛ-1β |
1,96±2,77* |
2,5±0,9 |
ИЛ-6 |
9,95 [4,28; 16,55]* |
2,85 [2,08;4,60] |
ИЛ-8 |
17,01 [7,3; 41,37]* |
8,7±13,9 |
ИЛ-10 |
1,2±0,2* |
4,1±1,35 |
Примечание: * - критерий достоверности различий между показателями больных СКВ и лиц группы сравнения;р<0,05
Таблица 3. Концентрации цитокинов и факторов ангиогенеза в сыворотке крови и моче пациентов с различным течением СКВ и лиц группы сравнения
Исследуемые показатели, пг/мл |
группа сравнения, n=20 |
острое течение, n=7 |
подострое течение, n=9 |
хроническое течение, n=24 |
VEGF сыворотки крови |
45,4 [39,1;60,3] |
253,5 [168,6;703]* |
291,7 [135,9;603,1]* |
224,9 [134,5;350,6]* |
VEGF мочи |
33,21 [18,8;41,0] |
299,5 [243;774,2]** |
258,6 [118,4;306,3]** |
243,3 [112,0;396,25] ** |
МСР сыворотки крови |
60,3 [39,2;109,4] |
570,1 [146,2;878,9]* |
397,5 [321;1126]* |
347,7 [147;1118]* |
МСР мочи |
252,6 [156,2;287] |
483,4 [199,6;795,9] |
354,2 [244;1278]** |
213,3 [129,5;549,9] |
ИЛ-6 сыворотки крови |
2,85 [2,08;4,6] |
13,3 [2,23;16,2]* |
4,92 [1,82;16,7]* |
12,15 [2,12;15,65]* |
ИЛ-6 мочи |
2,89 [1,53;3,29] |
12,6 [3,9;16,6]* |
7,9 [4,2;17,6]** |
9,65 [4,47;16,25]** |
ИЛ-8 сыворотки крови |
6,05 [4,99;9,20] |
4,66 [2,8;7,6]* |
8,75 [4,58;21,15]* |
5,53 [3,3;9,5]* |
ИЛ-8 мочи |
1,07 [1,00;11,6] |
16,3 [10,8;37,8]** |
20,4 [15,2;28,36]** |
11,1 [5,20;48,39]** |
Примечание: * - критерий достоверности различий биомаркеров в сыворотке крови больных СКВ и лиц группы сравнения;р<0,05;
** - критерий достоверности различий биомаркеров в пробах мочи у больных СКФ и лиц группы сравнения; р<0,05.
Таблица 4.Концентрации цитокинов и факторов ангиогенеза в сыворотке крови и моче у пациентов с различной степенью активности СКВ и лиц группы сравнения
Исследуемые показатели, пг/мл |
группа сравнения, n=20 |
I степень, n=25 |
II степень, n=9 |
VEGF сыворотки крови |
45,4 [39,1;60,3] |
224,9 [112,8;347,1]* |
304,9 [160,1;621,0]* |
VEGF мочи |
33,21 [18,8; 41,0] |
258,6 [129,9;376,7]** |
250,5 [118,4;322,7]** |
MCP сыворотки крови |
60,3 [39,2;109,4] |
430,3 [140,2;983,95]* |
442,6 [202,3;1589,0]* |
MCP мочи |
252,6 [156,18;287,] |
246,7 [169,1;518] |
451,7 [165,5;795,9] |
ИЛ-6 сыворотки крови |
2,85 [2,08;4,6] |
13,2 [1,51;15,7] |
11,85 [2,31;15,6] |
ИЛ-6 мочи |
2,89 [1,53;3,29] |
10,2 [4,58;19,4]** |
10,00 [3,9;12,6]** |
ИЛ-8 сыворотки крови |
6,05 [4,99;9,20] |
4,85 [1,95;7,4]* |
6,8 [4,96;25,3]* |
ИЛ-8 мочи |
1,07 [1,00;11,6] |
14,3 [6,5;40,0]** |
19,5 [9,05;48,0]** |
Примечание: * - критерий достоверности различий биомаркеров в сыворотке крови больных СКВ и лиц группы сравнения;р<0,05;
** - критерий достоверности различий биомаркеров в пробах мочи у больных СКФ и лиц группы сравнения; р<0,05.