нет
Внедрение современные методов исследования протеома мочи окончательно опровергло длительно существовавшее представление о том, что белки не присутствуют в моче здорового человека. В настоящее время белки, обнаруживаемые в моче человека методами протеомики на основе хромато-масс-спектрометрии и методами иммуноферментного анализа, выделяются из разных мочевыводящих путей [2,10]. Количественный и качественный составы белков мочи определяют функциональное состояние гломерулярного барьера и канальцевого аппарата, гемодинамику, концентрацию и качественный состав белков плазмы и системы регуляции их транспорта [13].
Анализ протеома мочи представляет собой быстро развивающуюся аналитическую технологию, которая направлена на создание нового, неинвазивного метода диагностики заболеваний почек и мочевыводящих путей. Моча является идеальной средой для исследования [9,11]. Сбор мочи у пациента отличается от такой процедуры, как традиционная биопсия почек доступностью, безопасностью, возможностью последовательного отбора проб, возможностью неинвазивного, прогностического и диагностического мониторингов заболевания, контроля эффективности лечения [12]. Установлено, что аналитическая воспроизводимость мочи при определении протеомного профиля мочи не зависит от долгосрочного замораживания, остается стабильной в течение нескольких лет, даже при хранении при -20 ° C. Воспроизводимость поддерживается в образцах, сохраняемых от 5- 6 часов при комнатной температуре или до трех дней при 4 ° С.
Одним из наиболее часто встречающихся урологических заболеваний почек и мочевыводящих путей во всех возрастных группах, как известно, является пиелонефрит (ПН) [7,8]. Установлено, что ведущую роль в течении острого ПН и его перехода в хронический воспалительный процесс, часто завершающийся развитием почечной недостаточности, играют нарушения иммунной защиты организма человека [6,7,8]. Дистрофические и деструктивные процессы в клетках паренхимы почек возникают задолго до клинической манифестации пиелонефрита. Совершенствование методов ранней диагностики и эффективного лечения пиелонефрита и его осложнений связывают с исследованием в моче молекулярных маркеров повреждения почечной паренхимы и мочевыводящих путей: цитокинов, острофазных белков, факторов ангиогенеза и фиброгенеза, играющих важную роль в формировании нефросклероза [14].
В исследование включена группа пациентов (21 человек) в возрасте от 49 до 63 лет с диагнозом «первичный пиелонефрит», проходивших лечение в НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии ГБОУ ВПО Саратовского ГБУ им. В.И. Разумовского Минздрава России. Оценку активности и тяжести воспалительного процесса у больных проводили по результатам комплексного обследования, включающего изучение жалоб и сбор анамнеза, обзорную рентгенографию почек и мочевых путей, ультразвуковое исследование, пошаговую, спиральную и мультиспиральную компьютерную томографию с реконструкцией изображения, магнитно-резонансную томографию, общий и биохимический анализ крови. Кроме того, в моче пациентов определяли общий белок, лейкоциты и эритроциты. Контрольную группу составили 20 практически здоровых лиц.
Для количественного анализа биомаркеров первую порцию утренней мочи в объеме не менее 100 мл собирали в специальные стаканы с крышками. Предварительно в емкость для забора мочи вносили 20 мкл раствора "ProClin 300" ("SUPELCO", США). Аликвоты мочи разливали в пробирки с крышками типа "Eppendorf" объемом 2 мл и хранили до проведения исследования при температуре -250С. Концентрацию интерлейкина-8 (IL-1β), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), моноцитарного хемоаттрактанта (МСР-1) в моче пациентов определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), используя соответствующие наборы реагентов ЗАО "Вектор-Бест" (Новосибирск). Исследование биомаркеров у больных пиелонефритом при поступлении в стационар выполняли до начала антибактериальной терапии. Для оценки диагностической чувствительности и специфичности вышеперечисленных биомаркеров применяли ROC-анализ. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета Statistica 6.1. В качестве критерия достоверности отличия между двумя независимыми группами использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Во всех процедурах статистического анализа принимали уровень значимости р<0,05.
Результаты исследования представлены в таб.1 и на рис.1.
Рис. 1. Кратность превышения концентрации биомаркеров мочи у больных острым пиелонефритом относительно контрольной группы.
Для сравнения диагностической значимости определения цитокинов и других исследуемых биормакеров в моче были использованы образцы этих биологических жидкостей, взятые у 21 больного острым ПН. В остром периоде ПН в моче концентрация всех исследуемых бимаркеров превышала значения контрольной группы в 10-1000 раз. Как видно наиболее значимым был подъем в моче концентрации Ил-8 (в 1000 раз). В меньшей степени нарастала концентрация VEGF и МСР-1. Значимый выброс с мочой медиаторов воспаления и факторов роста свидетельствовал о том, что у больных с острым пиелонефритам одновременно с началом формирования воспалительных процессов на уровне эпителиальной выстилки канальцев почек и интерстициальной ткани формировалась структурно-функциональная перестройка микрососудистого русла почек или его дезадаптивное ремоделирование с усилением ишемии и запустеванием внутриклубочковых и перитубулярных капилляров.
Тубулоинтерстициальное повреждение почек в остром периоде пиелонефрита можно считать результатом сложных межклеточных взаимодействий, осуществляемых при участии провоспалительных цитокинов и факторов роста. В острой стадии ПН резкое повышение продукции IL-8 в канальцевом эпителии, с одной стороны, приводит к активации воспалительной реакции в интерстиции, а с другой, - способствует формированию гемодинамических и метаболических нарушений на уровне почечных канальцев, эпителиоцитов и мезангиоцитов клубочков. В результате развиваются перемежающееся повреждение стенок сосудов, изменение тонуса сосудистого русла и усугубление ишемии почечной паренхимы, которые стимулируют секрецию факторов роста, прежде всего VEGF. В данном процессе активное участие принимает инфильтрат почечного интерстиция, основным компонентом которого являются моноциты/макрофаги; интенсивность их инфильтрации регулируется МСР-1. Информативность каждого из исследуемых биомаркеров определяли по величине площади под характеристической кривой (таб. 2). Выбор точек отсечения (cut off) проводили так, чтобы им соответствовали максимально возможные показатели чувствительности и специфичности анализируемых маркеров в выявлении активности воспалительного процесса в ткани почки.
Как видно концентрации IL-8, МСР-1 и VEGF в моче больных острым ПН, превышающие соответствующие значения cut off, могут применяться в качестве критериев тяжести воспалительного процесса. Высокое содержание биомаркера в моче, по-видимому, может служить предиктором развития артериальной гипертензии и формирования интерстициального фиброза, который, в конечном счете, способен привести к атрофии канальцевого эпителия и развитию почечной недостаточности.
Таким образом, нарастание в моче больных пиелонефритом на высоте обострения воспалительного процесса концентрации Ил-8 может использоваться как показатель поражения эпителия тубулярного аппарата почек; VEGF - для характеризации степени ишемии почечной паренхимы, а МСР-1 в качестве показателя тяжести тубулоинтерстициального повреждения.
Бактериальные агенты, вызывающие развитие острого ПН, приводят к изменению структурно-функциональных свойств и метаболизма эпителия мочевых путей. Все это сопровождается индукцией провоспалительных цитокинов, приводящей к инфильтрации тканевых структур, окружающих мочевыводящие пути, нейтрофилами и макрофагами, становится причиной дистрофии канальцевого эпителия. В результате у больных ПН развиваются воспалительные изменения паренхимы почек и дезаптивное ремоделирование сосудистого русла, которые являются причиной формирования фиброза и развития хронической болезни почек. Исследование таких белков в моче, как IL-8, МСР-1 и VEGF, можно считать неивазивной и безопасной для пациентов технологией диагностики и мониторинга, прогнозирования течения острого пиелонефрита, позволяющей повысить информативность и диагностическую ценность рутинных методов диагностики и снизить процент диагностических ошибок [1,4,5].
Таблица 1. Концентрация биомаркеров в моче пациентов с острым пиелонефритом
Определяемый биомаркер |
Условно здоровые |
Больные острым пиелонефритом |
ИЛ-8 пг/мл |
0,4; 0,0 – 12,1 |
414,5*; 93,3-1065,6 |
МСР-1 пг/мл |
253; 159 – 287 |
2456*; 2118 – 3629 |
VEGF пг/мл |
33; 19 -41 |
537*; 382 - 658 |
Таблица 2.Диагностическое значение биомаркеров в моче, рекомендуемые для оценки активности воспалительного процесса и степени ишемического поражения ткани почек при остром пиелонефрите
Показатели |
Ил-8 |
МСР-1 |
VEGF |
Площадь под кривой |
0,988 |
0,998 |
0,992 |
Значение cut off |
32 |
316 |
92 |
Специфичность |
0,95 |
0,97 |
0,94 |
Чувствительность |
0,94 |
0,99 |
0,99 |