Skip to Content

Формирование комплекса «актин–интегрин αIIbβ3–фибриноген» в динамике адреналин-индуцированной агрегации тромбоцитов: роль гетеротримерного G-белка Gαz

ID: 2016-11-7-T-9784
Тезис
ФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России

Введение. Стимуляция тромбоцитов с помощью различных растворимых агонистов (тромбин, АДФ, адреналин и др.), действующих через рецепторы, сопряженные с гетеротримерными ГТФ-связывающими белками (G-белками), является критически важным для формирования комплекса между актином, ин­тегрином αIIbβ3 и фибриногеном, обеспечивающего стабильность тромбоцитарных агрегатов. При этом роль отдельных G-белков в этом процессе требует уточнения.

Цель. Изучить ассоциацию интегринов αIIbβ3 с цитоскелетом тромбоцитов, а также стабильность связи между интегринами αIIbβ3 и фибриногеном при активации гетеротримерного G-белка Gαz.

Материалы и методы. В исследовании использованы образцы цитратной крови взрослых здоровых добровольцев, подписавших информированное согласие. Для селективной активации Gαz обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) инку­би­ровали с 0,5 мМ ацетилсали­циловой кислотой (АСК) и стимулировали добав­лением 50 мкМ адреналина. Агрегацию тромбоцитов наблюдали не менее 5 мин. Контролем служила ОТП, инкубированная с соответствующим растворителем и стимулированная адреналином. Для исследования ассоциации интегринов αIIbβ3 с цитоскелетом ОТП лизировали добавлением буфера с Тритоном X‐100, после чего нерастворимый материал (цитоскелетные фрак­ции) выделяли и подвергали вестерн-блоттингу с использованием антител против β-актина и αIIb. Содержание β-актина и αIIb в цитоскелете выражали в процентах от такового в контрольных тромбоцитах спустя 5 мин после стимуляции (100%). Для оценки стабильности связи между интегринами αIIbβ3 и фибриногеном через 3 мин после индукции агрегации в ОТП добавляли 4,5 мкМ эптифибатида (высокоселективный антагонист интегрина αIIbβ3). О стабильности связи судили по скорости эптифибатид-индуцированной дезагрегации тромбоцитов.

Результаты. Стимуляция тромбоцитов адреналином, действующим через α-адренорецепторы, сопряженные с G-белком Gαz, вызывала двухволновую их агрегацию. Первая волна агрегации достигала амплитуды 35,3 % ± 3,9 %. Вторая волна агрегации начиналась спустя 1,6 мин ± 0,1 мин после добавления адреналина и достигала максимальной амплитуды 85,1 % ± 6,4 %. Для того чтобы предотвра­тить возникновение второй волны агрегации, представ­ляющей собой результат синтеза тромбоксана А2 и активации тромбоксан-простаноидных рецепторов, сопряженных с G-белками Gαq и Gα12/13, тромбоциты были проинкубированы с АСК. Преинкубация с АСК отменяла вторую волну агрегации, так что максимальная амплитуда составила 38,2 % ± 4,2 %.

При исследовании цитоскелетных фракций было установлено, что цитоскелет покоящихся интактных тромбоцитов содержал 62,5 % ± 9,6 % β-актина и следы αIIb по отношению к их содержанию в цитоскелете контрольных тромбоцитов, стимулированных адреналином в течение 5 мин (100 %). Стимуляция тромбоцитов, инкубированных с АСК, в течение такого же времени приводила к максимальной полимеризации актина, но не сопровождалась ассоциацией αIIb с цитоскелетом.

Добавление эптифибатида спустя 3 мин после стимуляции контрольных тромбоцитов не вызывала их дезагрегации. В то же время добавление эптифибатида спустя 3 мин после стимуляции тромбоцитов, инкубированных с АСК, адрена­лином вызывало их стремительную дезагрегацию со скоростью 111,5 %/мин ± 15,4 %/мин, что свиде­тель­ствует о низкой стабильности образовавшихся агрегатов.

Заключение. Активация G-белка Gαz в тромбоцитах сопровождается максимальной полимеризацией актина, но не приводит к ассоциации интегринов αIIbβ3 с цитоскелетом. Образующиеся при этом тромбоцитарные агрегаты отличаются низкой стабильностью связи между интегринами αIIbβ3 и фибриногеном.

Ключевые слова

тромбоцит, цитоскелет, интегрины, фибриноген
0
Ваша оценка: Нет



Оптимальный хостинг для Drupal, Wordpress, Joomla, Битрикс и других CMS, быстрые и надежные сервера, круглосуточная техподдержка Яндекс.Метрика