Цель исследования – изучение биологических эффектов СВЧ-излучения плотностью потока мощности 100 пВт/см2 на состояние внутриклеточных механизмов трансдукции мононуклеаров цельной крови больных внебольничной пневмонией в острой фазе заболевания. Методом ИФА определялся цитокиновый статус и внутриклеточное содержание ряда молекул, обеспечивающих внутриклеточную трансдукцию. Показано, что облучение сопровождается ростом содержания белка р53 на 25%, NFκB 12,5%, IκB на 22%, фосфорилированной формы p38 MAPK на 18,2%, BCL-2 на 11,2%, цАМФ на 16,8%. Отмечено повышение продукции ИЛ-23 на 14% (0,001) и ИЛ-28А на 17,6% (р=0,031), выявлена тенденция к повышению ИЛ-22.
Формирование благоприятного течения восстановительного процесса после перенесенных заболеваний и оперативных вмешательств невозможно без нормализации иммунной регуляции [1].
Воспаление как типовой патологический процесс сопровождает развитие большинства заболеваний и патологических состояний, являясь наиболее важным патогенетических механизмом, определяющим их течение и исходы. В этой связи, нарушения межклеточной кооперации, наблюдающиеся в условиях неадекватной повреждению воспалительной реакции, являются предпосылками к развитию осложнений и затрудняют восстановление таких больных [1, 2].
Очевидно, что активация собственного потенциала организма в частности его иммунной системы, направленная на восстановление межклеточных взаимодействий является одним из основных условий полноценной реабилитации. При этом поиск и исследование новых лечебных факторов и механизмов следует считать актуальной и важной научно-практической задачей. В качестве одного из таких лечебных факторов, способных активировать саногенный потенциал клеточной системы организма следует рассматривать низкоинтенсивного СВЧ-излучения частотой 1000 МГц плотностью потока мощности (ППМ) ~100 пВт/см2 [4, 5, 6].
Биологический эффект указанного излучения, сопоставимого по своей мощности с собственным излучением организма, реализуется благодаря резонансному характеру взаимодействия электромагнитного излучения (ЭМИ) с молекулярной структурой воды с передачей энергии находящимся в водной фазе биомолекулам [4, 6].
Изучение молекулярных механизмов реализации биологических эффектов ЭМИ СВЧ в отношении иммунной регуляции у больных с воспалительной активацией иммунной системы (на модели пневмонии).
Обследовано 30 больных внебольничной пневмонией (ВП) в острой стадии заболевания (5-7 сутки) в возрасте 20-35 лет.
Оценка характера биологических эффектов СВЧ-излучения проводилась путем исследования цитокинового статуса (определение интерлейкина (ИЛ) 22, 23, 28А), уровня митоген-активированной протеинкиназы p38 MAPK, ядерного фактора транскрипции NFκB и его ингибитора IκB, цАМФ, белка р53 и BCL-2 и продукции антимикробного пептида LL-37 (кателицидиа).
Основная группа была разделена на две подгруппы. Первая подгруппа – включала необлученные образцы крови больных ВП, вторая – образцы подвергнутые СВЧ-облучению в течении 45 минут. Контрольную группу составили 15 практически здоровых лиц, сопоставимых по возрасту с основной группой.
Облучение проводилось аппаратом микроволновой терапии «Акватон-02» (ООО «ТЕЛЕМАК», г. Саратов), на частоте 1000±0,01 МГц. По окончании облучения образцы крови инкубировали в течение 24 часов при 370 C, после чего в клеточном супернатанте оценивали продукцию ИЛ-22, ИЛ-23, ИЛ-28А, цАМФ, р53, LL-37. В лизате мононуклеаров, выделявшихся на градиенте фикол-верографин, определяли содержание NFκB, IκB, BCL-2 и p38 MAPK.
Статистическая обработка проводилась в программе Statistica 7,0. при этом рассчитывалось среднее значение (m) и среднеквадратичное отклонение (σ). Статистическая значимость (р) межгрупповых различий оценивалась с помощью t-критерия.
Уровень исследуемых факторов у больных представлен в табл.1. Формирование воспаления сопровождалось увеличением продукции ИЛ-22 в 2,6 раза (р = 0,0012), ИЛ-23 в 1,5 раза (р = 0,021), ИЛ-28 в 2,4 раза (р = 0,0041). Так же отмечено повышение внутриклеточного уровня NFκB в 2,3 раза (р = 0,012), IκB в 2 раза (р = 0,017), p38 MAPK на 62% (р = 0,048), BCL-2 в 2 раза (р = 0,0019), LL-37 на 46,2% (р = 0,0007). Кроме того отмечено снижение содержания цАМФ на 20,3% (р = 0,061), белка р53 на 22,6% (р=0,045). Установлено, что у заболевших соотношение NFκB/IκB, отражающее активацию генетических программ воспалительного процесса, повышалось с 1,26 до 1,47, а соотношение BCL-2/p53, отражающее баланс процессов апоптоза и пролиферации, увеличивалось в 2,6 раза c 0,97 до 2,5.
Полученные данные указывают на существенную активацию иммунной системы, в частности антигенпрезентирующих клеток, а так же высокую активность ядерной транскрипции.
СВЧ-облучение сопровождалось ростом продукции ИЛ-23 и ИЛ-28А на 14% (р = 0,001) и 17,6% (р = 0,031) соответственно, а так же ИЛ-22 на 13,3% (р = 0,23) и LL-37 на 4,4% (р = 0,01). Так же отмечено повышение концентрации NFκB на 12,5% (р = 0,001), а IκB на 21,1% (р = 0,00072), со снижением их соотношения с 1,47 до 1,37. Кроме того облучение сопровождалось ростом внутриклеточного содержания фосфорилированной формы p38 MAPK на 18,2% (р = 0,011).
Анализ взаимодействий в системе пролиферации и апоптоза показал способность облучения существенно повышать уровень белка р53, контролирующего множество внутриклеточных процессов, включая репарацию поврежденной ДНК на 25% (р < 0,001). Учитывая многогранную контролирующую роль р53 в клетке, полученные данные свидетельствуют об активации внутриклеточных механизмов регулирующих стрессорные реакции [2, 7].
Установлено, что облучение способствовало росту продукции антиапоптотического белка BCL-2 на 11,5% (р = 0,12), и цАМФ на 16,8% (р = 0,2).
Хорошо известно, что взаимодействие бактериальных антигенов с Toll-подобными рецепторами антигенпрезентирующих клеток и их активация сопровождается синтезом провоспалительных цитокинов, в том числе, определяющих дифференцировку Т-хелперных клонов и регулирующих иммунологическую реактивность (ИЛ-1, ИЛ-12, ИЛ-23 и др.) [1, 2].
В этих условиях семейство ИЛ-12 играет существенную роль в дифференцировке Т-хелперных клонов и формировании Th1 типа иммунного ответа, усиливая так же цитотоксическую активность NK клеток. Известно, что ИЛ-23, входящий в семейство ИЛ-12, поддерживает пролиферацию Т-клеток памяти, активирует Т-хелперы-17 и реализует некоторые другие эффекты ИЛ-12. Активация Т-хелперов 1 типа и клеток памяти сопровождается продукцией ИЛ-22, стимулирующего продукцию белков острой фазы, антимикробных пептидов и матриксных металлопротеиназ [2].
В ответ на антигенное стимулирование антигенпрезентирующих клеток вирусными антигенами и липополисахаридами некоторых бактерий усиливается так же секреция интерферонов I типа, и, в частности, ИЛ-28А являющегося регулятором адаптивного иммунного ответа и антивирусной защиты.
Кроме того, активация Toll-рецепторов приводит к активации протеинкиназ, в частности p38 MAPK с фосфорилированием ряда белков входящих в состав транскрипционного фактора AP-1, ответственного за формирование воспалительного ответа и синтез антимикробных пептидов, в частности кателицидина, сурфактантных белков и др. молекул. Кроме того, провоспалительные цитокины, в частности ИЛ-1, активируют фактор транскрипции NFκB контролирующий синтез провоспалительных интерлейкинов, поддерживающих воспалительный ответ.
Однако в реальных условиях существования организма находится множество внешних и внутренних факторов, не позволяющих максимально эффективно и полноценно активизировать имеющийся саногенный потенциал. При этом в ряде случаев антигенная агрессия не формирует адекватного иммунного ответа, что создает предпосылки к затяжному и хроническому течению патологического процесса [1, 2].
О перспективности использования низкоинтенсивного СВЧ-излучения, в качестве регулятора внутриклеточного метаболизма, свидетельствует его влияние на продукцию факторов, определяющих реализацию программ воспаления, апоптоза и клеточного выживания. Активация каскада митоген-активируемых протеинкиназ приводящая к росту фосфорилированной формы p38 MAPK является пусковым стимулом активации транскрипционных факторов и протеина p53. Нормализация концентрации белка р53, контролирующего множество эффектов, направленных на минимизацию последствий повреждения ДНК и нарушения клеточного метаболизма, наряду со снижением соотношения BCL-2/p53, позволяют говорить об усилении контроля над клеточным метаболизмом [2, 7, 8].
Касаясь биофизических механизмов взаимодействия ЭМИ с клеткой, важно отметить ведущую роль воды в формировании биологических эффектов облучения. Учитывая, что молекулярная структура воды является колебательной системой способной к резонансному взаимодействию с внешним СВЧ-полем, значительную роль в формировании биологических эффектов облучения играет трансформация и передача СВЧ-энергии с молекул воды на связанные с ними биомолекулы [4].
Первичной мишенью СВЧ-волн, очевидно, являются наиболее лабильные звенья внутриклеточных механизмов внутриклеточной трансдукции − протеинкиназы. Модификация их активности сопровождается активацией факторов транскрипции с соответствующими изменениями продукции информационных молекул – интерлейкинов и эффекторных молекул воспаления [2, 7].
Наблюдаемая каскадность формирования биологических эффектов ЭМИ указывает на физиологичность воздействия, а сами СВЧ-волны выступают в качестве подстроечного регулятора активности молекулярных механизмов восприятия и внутриклеточной передачи рецепторной информации.
Таблица 1
Уровень исследуемых медиаторов в группах
Показатели |
Группы |
||
1 |
2 |
Контрольная |
|
ИЛ-22, пг/мл |
4,4±1,5 |
5,0±1,5 |
1,7±0,3 |
ИЛ-23, пг/мл |
3,5±0,4 |
4,0±0,31 |
2,3±0,1 |
ИЛ-28А, пг/мл |
3,4±1,1 |
4,0±1,1 |
1,4±0,3 |
NFκB, нг/мл |
5,6±0,8 |
6,3±0,8 |
2,4±0,2 |
IκB, нг/мл |
3,8±0,52 |
4,6±0,56 |
1,9±0,1 |
p38 MAPK, нг/мл |
3,3±0,48 |
3,9±0,44 |
2,1±0,2 |
BCL-2, нг/мл |
6,1±1,6 |
6,8±1,5 |
3,0±0,8 |
цАМФ, нг/мл |
5,02±1,3 |
5,84±1,3 |
6,3±0,9 |
p53, Ед/мл |
2,4±0,35 |
3,0±0,1 |
3,1±0,27 |
Кателицидин, мкг/мл |
5,2±0,19 |
5,43±0,14 |
2,8±0,05 |