Введение. Рак мочевого пузыря является самым частым новообразованием мочевыводящих путей.  Ежегодно в мире раком мочевого пузыря заболевают 335,8 тыс. человек  и 132,4 тыс. человек, то есть  каждый третий  умирает от этого заболевания.   В 2011 году в Российской Федерации диагностировано 13784 случая РМП, при этом прирост этого заболевания за последние 10 лет составил 15,26%. Летальность от РМП на первом году с момента установления диагноза составляет 19,5% [1]. 

Сегодня в России под динамическим наблюдением находятся около 60 тысяч больных раком мочевого пузыря и только у 33,6% болезнь диагностируется на Т1 стадии заболевания [2].  Известно, что именно стадия рака мочевого пузыря определяет вид, характер лечения и прогноз заболевания для пациента. Вместе с тем частота ошибок, при определении стадии рака мочевого пузыря   достигает 73% [3].

В настоящее время определение общепринятых критериев стадии рака мочевого пузыря:  глубина инвазии опухоли, степень дифференцировки клеток, поражение регионарных лимфатических узлов и т.д.,  не всегда приводят к положительному результату лечения. Это подтверждают и данные анализа отдаленных результатов лечения больных с одной и той же диагностированной стадией раком мочевого пузыря. У одних пациентов после органосохраняющей операции наблюдается благоприятный исход, у других – быстро развивается рецидив и прогрессия опухоли. Это можно объяснить не изученным биологическим потенциалом рака мочевого пузыря [4]

Хорошо известно, что по клиническому течению выделяют поверхностный (Tis, Ta, T1), инвазивный (T2 -T4) и метастатический рак мочевого пузыря.

В Российской Федерации выявление  больных с поверхностной формой рака (I стадия) составляет лишь 33,6%, в противоположность зарубежным данным, в соответствии с которыми I стадия рака мочевого пузыря диагностируется в 80% наблюдений.  В нашей стране в 11,6-15,6% наблюдений выявляется IV стадия  рака мочевого пузыря [5]

Эти цифры не внушают оптимизма и отражают неудовлетворительную диагностику поверхностного рака мочевого пузыря,  позднюю обращаемость пациентов и неточное определение стадии заболевания и как следствие - неадекватность проводимого лечения – органоуносящие операции со снижением качества жизни больных и более высокая смертность. 

Анализ результатов лечения больных раком мочевого пузыря показал, что назрела необходимость поиска новых дополнительных маркеров ранней диагностики, установления стадии и определении прогноза заболевания.

В клинических рекомендациях, выпущенных по инициативе Российского общества онкоурологов с разрешения Европейской ассоциации по урологии, в 2011 году  сведения по применению конкретных молекулярных маркеров для диагностики рака мочевого пузыря отсутствуют. Нет их и в стандартах диагностики и лечения рака мочевого пузыря как  в России, так и в Европе. Все вышесказанное позволило нам сформулировать цель нашего исследования.

Цель исследования: разработать панели молекулярно-биологических и иммуногистохимических маркеров  для ранней  диагностики, стадирования и прогрессирования рака мочевого пузыря.

Материал и методы. Исследование проводилось в несколько этапов.  На первом этапе делали акцент на поиск маркеров для ранней диагностики  РМП и в рамках федеральной целевой программы по борьбе с социально-значимыми исследованиями  в 2008 году было начато исследование.

Проведено обследование 488 больного, находившихся  на лечении в НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии Саратовского государственного медицинского университета им. В.И.Разумовского  с диагнозом рак мочевого пузыря: 443 человека - основная группа,  группа контроля – 25 практически здоровых лиц,   группа сравнения -  20 пациентов  с циститом и мочекаменной болезнью.

Возраст пациентов с раком мочевого пузыря колебался от  44  до 79 лет (средний возраст - 63 года).  В числе обследованных пациентов  - 60 женщин и 383 мужчин. Из 443 пациентов  с раком мочевого  пузыря   в группу с поверхностным раком (Та-1N0M0) – включены 217(48,9%) человек, мышечноинвазивным раком  без метастазов(T2-4N0M0) – 188(42,4%) человек и с метастатическим раком было- 38(8,6%) больных.

При гистологическом исследовании у всех 443 больных диагностирован переходноклеточный рак. По степени дифференцировки опухоли больные были распределены следующим образом: 223(50%)  больных с высокодифференцированной опухолью (G1), 174(39%) больных с умереннодифференцированной опухолью (G2), 60(11%) больных с низкодифференцированной опухолью (G3).

Исследование содержания онкомаркеров, цитокинов, факторов ангиогенеза проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа. Определение онкомаркеров-фрагментов цитокератинов проводили в сыворотке крови и моче.  

Содержание факторов роста эндотелия сосудов, трансформирующего фактора роста, фактора роста фибробластов определяли в сыворотке крови, маркеры апоптоза, интерлейкина-12, фактора некроза опухоли исследовали во взвеси мононуклеаров в плазме.

Иммуногистохимические реакции проводили на серийных парафиновых срезах,  используя  стрептавидин-биотиновый метод. Для иммуногистохимического исследования были использованы 13 коммерческих моноклональных антител, разделенные на группы по функциональной значимости:  маркеры пролиферативной активности; супрессор опухолевого роста;  маркеры апоптоза;  рецептор эпидермального фактора роста;   цитокератиновый профиль.

Интенсивность реакций, локализованных в цитоплазме, оценивали полуколичественным способом по 3-х балльной шкале.

Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию,  оценивали в процентах, подсчитывая количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения.

Статистический анализ проводили с использованием стандартного пакета программ статистической обработки результатов. Общая диагностическая эффективность количественных тестов определена с помощью ROC-анализа.

Результаты. Проведенные исследования на 13 иммуногистохимических и 11 молекулярно-генетических маркерах позволили выбрать наиболее информативные маркеры ранней диагностики  рака мочевого: определение онкомаркера рака мочевого пузыря (UBC) в моче; фрагмента цитокератина ТРS  в сыворотке крови  и маркеров пролиферативной активности  Кi67, Р63 и антигена  пролиферирующего клеточного ядра в тканях опухоли методом иммуногистохимии. 

Были установлены значения в разных группах: у практически здоровых лиц, с заболеваниями мочевого пузыря неопухолевой природы и РМП (табл. 1).

По нашим данным повышение маркера UBC в моче больше чем 50,1 мкг/л – это повод для детального обследования  пациента. Резкое увеличение данного маркера в крови  определяется при начале инвазии опухоли в мышечный слой.

При прорастании опухоли в сосуды, фрагменты этих же цитокератинов (ТРА и ТРS) появляются в кровотоке.  Нарастание  содержания  этих маркеров в сыворотке крови коррелирует со степенью  инвазии опухоли.

Из всех изучаемых маркеров роста наиболее значимым в диагностике рака мочевого пузыря оказался фактор роста эндотелия сосудов. Его резкое увеличение является неблагоприятным фактором  прогноза рака. Изменение уровня  факторов апоптоза (Fas и Fas-лиганда) можно использовать только в качестве прогностического фактора, так как их увеличение обусловлено процессом активного распада лимфоцитов, что неизбежно приведет к иммуносупресии и прогрессу опухолевого роста.

При анализе показателей экспрессии иммуногистохимических маркеров, имеющих ядерную локализацию, в различных группах больных с раком мочевого пузыря были получены следующие результаты:

Наиболее информативными были маркеры пролиферации (Ki67) и белки - регуляторы клеточного цикла  (Р53 и Р63) , которые не дают  экспрессии в группе сравнения.  Кроме того, при применении маркеров  Ki67и  Р53 отмечена высокая степень  корреляционной зависимости  между стадией рака мочевого пузыря, процентом экспрессирующих клеток и интенсивностью иммуногистохимической реакции. 

При иммуногистохимическом исследовании на антигены, локализованные в  цитоплазме, было установлено, что их экспрессия во всех исследованных группах больных является положительной. Достоверно значимых различий между группами больных по показателям иммуногистохимических реакций с цитокератинами не выявлено. 

И только цитокератин 18  продемонстрировал трехкратное увеличение количества экспрессирующих клеток уротелия  между группой сравнения  и группой больных с неинвазивным раком.

Таким образом, первый этап проведенных  исследований на 13 иммуногистохимических и 11 молекулярно-биологических  маркерах позволил установить следующие маркеры ранней диагностики: (UBC) в моче; фрагмента цитокератинов ТРS и TPA в сыворотке крови  и маркеров пролиферативной активности  Кi67, Р63 и антигена  пролиферирующего клеточного ядра в тканях опухоли методом иммуногистохимии. 

На втором этапе проведенных исследований была установлена связь изменений уровней цитокератинов TPA, TPS и UBC с признаками инвазии и стадией заболевания у больных РМП  с различным уровнем инвазии опухоли (табл. 2).

Как видно из представленной таблица  у больных с мышечно-инвазивным раком мочевого пузыря (Т2-Т4)  характерны   значения онкомаркера  UBС выше чем 64,1 мкг/мл,  ТРS >106,93 Ед/л и  TPA> 1,89нг/мл.  У больных с  раком мочевого пузыря без мышечной инвазии показатели этих онкомаркеров  - нижеуказанных величин. 

При определении чувствительности и специфичности каждого маркера мы получили достаточно высокие показатели  между этими показателями (табл.3).

Проведенный РОС – анализ показал статистически значимые различия между стадиями РМП по всем трем маркерам (табл. 4, рис. 1).

Далее нами был проведен сравнительный анализ ошибок в маркерной диагностике глубины инвазии опухоли на дооперационном этапе и в послеоперационном периоде с морфологическим исследованием (табл.5).

Было установлено, что при раке мочевого пузыря без мышечной инвазии наиболее целесообразно использовать уринальный онкомаркер UBC, так как у него высокая чувствительность (88%) в верификации и стадировании (82%) переходноклеточной карциномы и самая маленькая ошибка (16%). Не высокая  чувствительность и точность  в установлении стадии Та-Т1 с помощью TPA и  TPS вполне объяснима, так как появление их в сыворотке крови происходит при прорастании опухоли в стенку сосуда, что происходит при инвазивном росте.

При мышечно-инвазивном РМП сохраняется высокая чувствительность UBC, а  точность в определении стадии снижается, что может объясняться большим размерами опухоли и ее экзофитным ростом. В тоже время исследование сыворотки крови на TPA и TPS показывает значительное увеличение в точности стадирования и снижении величины ошибки.

Следует отметить, что для уточнения стадии РМП наиболее целесообразно применение одновременно всех трех онкомаркеров, так как это увеличивает чувствительность и специфичность применяемого метода, что подтверждается данными проведенного RОC-анализа.

Применение всех трех маркеров позволяет провести дифференциальную диагностику доброкачественного и злокачественного процессов,  поверхностного и мышечно-инвазивного РМП, а также уменьшить количество диагностических ошибок в определении стадии, которая по данным некоторых авторов составляет 68-72% [6]. В клинике урологии и НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии  СГМУ до применения маркерной диагностики общая ошибка в определении стадии  заболевания составляла 44, 25%, к  2012году она уменьшилась до 15,2%.  В 2012 году  на «Способ диагностики стадии инвазии рака мочевого пузыря» с применением данных маркеров был получен патент на изобретение.(№2454181 от 27.06.2012)

При иммуногистохимическом исследовании 12 онкомаркеров было установлено, что для диагностики стадии рака мочевого пузыря и прогноза заболевания рационально использовать только 4 маркера: Ki-67, p63, р53 и  EGFR (табл.6).

Как видно из представленной таблицы, данные маркеры не дают положительной экспрессии в группе сравнения, что может использоваться при дифференциальной диагностике РМП и других неоплазий. Кроме этого процент экспрессирующих клеток указанных маркеров позволяет судить о степени инвазии РМП, что является важным моментом для определения стадии заболевания, а, следовательно, и прогноза.

При анализе показателей экспрессии маркеров в каждую из стадий РМП, представленной было установлено, что маркер Ki-67 показал 100% экспрессию у пациентов со стадией РМП Т3 и Т4, в то время как в стадию Т2 его экспрессия составила только 56,5%, что является достоверным различием (табл. 7).

Исследования показали: Ki-67 можно весьма перспективно использовать для дифференциальной диагностики между Т2 и Т3-Т4, что является очень важным, так как выход опухоли за пределы органа свидетельствует о неблагоприятном прогнозе и именно поэтому этот маркер может быть использован как прогностический, способный повлиять на выбор тактики лечения у больных МИРМП.

С целью определения прогностической значимости были изучены отдаленные результаты лечения 27 больных РМП, чью судьбу удалось проследить на протяжении 5 лет. У всех пациентов при иммуногистохимическом исследовании ткани опухоли Ki-67 дал положительную экспрессию.

Из 27 больных РМП 11 пациентам было выполнено органосохраняющее комплексное лечение, включающее в себя трансуретральную электрорезекцию стенки мочевого пузыря вместе с опухолью и системную полихимиотерапию по схеме M-VAC (метотрексат, винбластин, доксорубицин, цисплатин). У 13 больных произведена цистэктомия, а шесть пациентов признаны иноперабельными, им осуществлялась только симптоматическая терапия (табл.8).

Из представленной таблицы видно, что из 27 больных РМП – 16 (59,2%) умерло. Из них 10 (62,5%) - в первый год. Из 10 умерших в первый год 9 (90%) пациентов имели экспрессию Ki-67 ≥ 30%. У всех 9 больных стадия заболевания была Тзb-T4N0-1M0-1.

В то же время из 11 больных РМП, которые прожили более 5 лет, в 73% случаев экспрессия  Ki-67 составила < 30%. Стадия заболевания у выживших больных была: Т1N0M0 - 4; Т2N0M0 - 6; Т3N0M0 - 1.

При мышечно-инвазивном РМП Т2N0M0-Т3-4N0-1M0-1 (22 больных) в первые 24 месяца умерли  14 (62%). Экспрессия Ki-67 у этих больных колебалась от 30 до 80%.

При органосохраняющем лечении больных в стадии Т1-Т2 (11 пациентов) в первые два года умерло 5 (45,4%) больных, у которых экспрессия Ki-67 составляла ≥ 30%. После цистэктомии (n=13) умерло 8 (61,5%), у 7 (87,5%) из них Ki-67 был > 30%. Из 11 пациентов, проживших 5 лет и более, только в двух случаях Ki-67 было > 30% (34% и 44%), у остальных 9 (82%) – Ki-67 был менее 30%.

Проведенная сравнительная оценка эффективности различных иммуногистохимических маркеров в определении стадии и прогнозе мышечно-инвазивного РМП показала, что наиболее эффективным маркером является маркер пролиферативной   активности – Ki-67. Установлено, что при экспрессии Ki-67 > 30%, независимо от способа  лечения, в 81,2% возможен рецидив заболевания и летальный исход в течение 24 месяцев. В то же время при значениях Ki-67 < 30% пятилетняя выживаемость составляет 70%.

Таким образом,  научно-исследовательская работа, проводимая и НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии более 6 лет, и являющаяся отражением интеграции  клинической урологии,  лабораторной диагностики и морфологии позволила вывить наиболее значимые маркеры в ранней диагностике, определении стадии и прогноза рака мочевого пузыря.   

Выводы

1. Для раннего выявления рака мочевого пузыря, а также проведения дифференциальной диагностики между доброкачественным и злокачественным процессом,  целесообразно    определение онкомаркера рака мочевого пузыря (UBC) в моче; фрагментов цитокератинов ТРS,ТРА  в сыворотке крови  и маркеров пролиферативной активности  Кi67, Р63 и антигена  пролиферирующего клеточного ядра в тканях опухоли методом иммуногистохимии.  Применение данных маркеров  в НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии СГМУ  позволило  повысить выявление рака мочевого пузыря на 1стадии  с 18,1% в 2006 г. до 48,9% в 2011 г. и  увеличить число органосохраняющих операций за этот же период времени с 57%  до 82%
2. Включение онкомаркеров UBC, TPA и TPS  в комплексную диагностику и стадирование рака мочевого пузыря позволяет провести дифференциальную диагностику доброкачественного и злокачественного процессов,  поверхностного и мышечно-инвазивного РМП и  снизить частоту диагностических ошибок  с 44,2% до 15,2%.
3. Маркер пролиферативной активности Ki-67 может быть использован в качестве вспомогательного маркера  при выборе объема оперативного лечения (органосохраняющая операция или цистэктомия). Кроме того независимо от способа лечения в 81,2% случаев Ki-67 может предсказать неблагоприятный исход заболевания в течение 24 месяцев.
4. Применение  молекулярно-биологических и иммуногисто-химических маркеров в диагностике рака мочевого пузыря позволило за последние пять лет увеличить  объем радикальных операций с 78% до 92,1% и уменьшить летальность у данной категории больных в первые 2 года после проведенного лечения с 32% до 15,9%