В экспериментах in vivo проведено исследование противоопухолевой активности экстракта аврана лекарственного при различных способах введениях в дозе 110 мг/кг/сут на протяжении 12 дней у крыс с перевитым раком почки (PА). Установлено, что внутримышечное введение экстракта является наиболее эффективным, и приводит к замедлению темпов роста опухоли и уменьшению конечного объема опухоли на 40% по сравнению c размерами опухоли у животных без воздействия экстракта. При пероральном введении экстракта также происходит замедление темпов роста опухоли, а к окончанию эксперимента (14 сутки) объем опухоли уменьшается на 23% по сравнению с группой крыс без воздействия. Гистологические изменения в опухолевой ткани были более выражены при внутримышечном введении и проявлялись некробиотическими и атрофическими изменениями в клетках, снижением пролиферативной активности, отсутствием митозов и уменьшением экспрессии ядерной РНК, что может говорить о блокировке синтетических процессов на уровне ядра. Таким образом, наиболее выраженный патоморфоз перевитого рака почки под влиянием экстракта аврана лекарственного наблюдается при внутримышечном пути введения эстракта.
Введение. В настоящее время нет ни одного противоопухолевого препарата, который был бы безопасен в рекомендуемых для клинического применения дозах и не имел бы ограничений для использования [1]. Недостатками имеющихся противоопухолевых препаратов являются их токсическое влияние на неизмененные органы и ткани организма и развитие к ним устойчивости опухолей [2]. Это делает необходимым поиск новых, более безопасных и высокоэффективных лекарственных средств.
Особое внимание уделяется созданию лекарственных средств растительного происхождения с минимальными побочными эффектами. Препараты из растительного сырья могут использоваться не только для уничтожения опухолевых клеток, но и защиты нормальных клеток (в том числе, и стволовых клеток костного мозга) при проведении стандартного курса химио- и радиотерапии [1,2,3].
Самой перспективной группой, по мнению ряда авторов, являются флавоноиды, так как обладают наибольшим количеством биологических эффектов, оказывающих положительное влияние на результат лечения новообразований [2,3]. Открытие в 2011 году способности растительного флавоноида вогонина к активации апоптоза в опухолевых клетках [4] позволило продолжить поиск и других биофлавоноидов, обладающих противоопухолевой активностью.
При различных способах извлечений из цветков и листьев аврана можно получать биологически активные композиции, обладающие различными свойствами: слабительным, рвотным, спазмолитическим, диуретическим, дигиталисоподобным действием на сердце, противовоспалительным, антиоксидантным, иммуномодулирующим, противотуберкулезным и др. [5-9].
Ранее на лабораторных животных с перевитыми опухолями нами было показано, что флавоноидсодержащий экстракт аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.), наряду с малой токсичностью, обладает противоопухолевой активностью в отношении перевиваемого рака печени [10-14]. Исследований противоопухолевого действия экстракта аврана на перевитые опухоли почки у крыс ранее не проводили.
Цель исследования: в экспериментах in vivo исследовать противоопухолевую активность флавоноидсодержащего экстракта аврана лекарственного на модели перевитого рака почки у крыс.
Материал и методы. Использовали водные растворы экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.), собранного в экологически чистом районе, на острове Чардым Саратовской области. Экстракты были получены нами авторским способом (Патент РФ 2482863), позволяющим существенно повысить выход биофлавоноидов и предусматривающим минимальный выход токсичных соединений (алкалоидов, гликозидов и др.) [15], что особенно актуально при получении нетоксичных экстрактов ядовитых растений, к которым относится авран лекарственный. Ранее в составе травы аврана была описана бетулиновая кислота, обладающая противоопухолевой активностью, но использованная нами технология получения экстракта исключала выход данного соединения [15]. Экстракт, полученный данным способом из аврана лекарственного имеет следующий химический состав: 4-винил-2-метоксифенол; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он; 2,3-дигидробензофуран; 3-фуранкарбоновая кислота; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; этил-a-d-рибозид; 4-пропилфенол; пирокатехин; L-луксоза (пентоза); 6-деоксигексоза L-галактоза; бензоилуксусной кислоты этиловый эфир; гексадекановая кислота (пальмитиновая кислота); гомованилиновая кислота; глюкоза; 1,4-ангидро- d-маннитол; бензойная кислота; кверцетин. Среднее значение кверцетина в данном экстракте с использованием градуировочного графика стандартного образца кверцетина (98%) Sigma, составляет 0,66%. Установленное нами методом жидкостной хроматографии количество кверцетина в сухом остатке экстрактивных веществ (получаемого из 10 г сухой травы аврана) составило 350 мкг [15]. Экстракт получен на Кафедре общей биологии, фармакогнозии и ботаники СГМУ им В.И, Разумовского, вводили животным в виде водного раствора (концентрация экстракта 100 мг/мл ).
Работу с лабораторными животными осуществляли согласно протоколу исследований, не противоречащему Женевской Конвенции 1985 г. о «Международных принципах биомедицинских исследований с использованием животных». Протокол исследований одобрены этической комиссией ФГБОУ ВО СГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава РФ (протокол №13 от 3 мая 2011 г.).
В эксперименте, проведенном в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [17] на базе Центра коллективного пользования НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии СГМУ, было использовано 30 самцов белых лабораторных крыс линии Wistar, массой 150±50 г, которым имплантировали подкожно в области лопатки по 0,5 мл 25% опухолевой взвеси рака почки РА в растворе Хэнкса. Опухоль была получена из банка опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.Н. Блохина.
Животные с перевитым раком почки методом случайной выборки были разделены на три группы по 10 крыс: первую и вторую – опытные, крысы получали экстракт аврана либо перорально, либо внутримышечно в дозе 110 мг сухой массы экстракта/кг/сутки. Третью группу - сравнения, составили животные с перевитой опухолью, но без введения экстракта. В опытных группах через 72 ч после трансплантации опухоли крысам вводили физиологический раствор ежедневно в течение двух недель, после чего животных всех групп выводили из эксперимента путем декапитации и производили забор образцов ткани опухоли.
Динамику роста опухоли оценивали по изменению ее объема по формуле: V=АхВхС, где А– ширина, В – толщина, С – высота опухоли. Измерения проводили электронным штангенциркулем каждый день от начала эксперимента. Высчитывали индекс торможения роста опухоли (ИТРО) – показатель эффективности противоопухолевого препарата, вычисляемый по формуле: ИТ= [(Mконтр –Mопыт)/ Mконтр]*100%, где Mконтр – средняя масса опухоли в группе контроль, а Mопыт – опытной группы (Вычисляется масса опухоли, полученная на конец эксперимента).
Для изучения патоморфоза опухоли применяли морфологические и морфометрические методы с использованием стандартных гистологических методик окраски гематоксилином и эозином, по Романовскому-Гимзе; гистохимические методики: PAS реакция, а также окраска метиловым зеленым пиронином по Браше для выявления ДНК и РНК, иммуногистохимическое окрашивание на маркер пролиферации Ki-67. Индекс пролиферации рассчитывался, как отношение положительно окрашенных клеток (Ki67), к общему количеству клеток в поле зрения. Учитывали наличие дистрофических и некробиотических изменений в опухолевых клетках, а также такие цитоморфометрические показатели, как диаметр опухолевой клетки, диаметр ядра опухолевой клетки, ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ), среднее количество клеток в поле зрения. Подсчет проводили на 100 клеток в 10 полях зрения каждого микропрепарата, с помощью Микровизора медицинского проходящего света µVizo-103 на увеличении 774. При статистической обработке данных нормальность распределения показателей в группах была проверена при помощи критерия Шапиро-Уилка. Для сравнения средних полученных показателей был использован критерий Крамера-Уэлча (Т), при котором разность средних арифметических двух выборок (контрольной и экспериментальной) делится на естественную оценку среднего квадратического отклонения этой разности. При данном методе разность средних с вероятностью в 95% определяется при Т≥1,96. Весь статистический анализ выполнен при помощи программного обеспечения STATISTICA 10.0 Interprise.
Результаты и обсуждение. При внутримышечном введении экстракта аврана отмечали статистически значимое (Т≥1,96) замедление темпов роста перевиваемого рака почки, чем в группе сравнения во все дни измерений. На момент окончания эксперимента объем опухоли в этой группе составил 6.7±0.53 см3 и был на 40 % меньше (Т≥1,96), чем в группе сравнения (11±0.92 см3).
При пероральном ведении экстракта аврана наблюдали замедление темпов роста опухоли (Т≥1,96) по сравнению с крысами группы сравнения с пятого по десятый день и с двенадцатого по четырнадцатый день введения экстракта. На момент окончания эксперимента объем опухоли в этой группе с составил 8,55±0.26 см3 и был на 23 % меньше (Т≥1,96), чем в группе сравнения (11±0.92 см3). Следует отметить, что именно в этой группе животных с 9 по 11 день отмечали самый медленный темп прибавки массы опухоли. (Рис.1).
Индекс торможения по массе опухоли составил 71% для перорального введения и 73 для внутримышечного пути введения экстракта аврана лекарственного. (Табл. 1)
Патоморфоз рака почки
При гистологическом исследовании в ткани опухоли под действием аврана обнаружены обширные зоны некроза и дистрофические изменения опухолевых клеток, а также апоптозные тельца (рис. 2б). В группе сравнения (без лечения) встречали фигуры митозов (до 2 в поле зрения), чего не отмечали в опытных группах.
При проведении морфометрии наблюдали статистически значимое снижение среднего числа клеток в поле зрения в два раза при внутримышечном введении и 1,6 раза при пероральном введении (табл. 2).
Выявили уменьшение размеров диаметра ядра при внутримышечном введении в 1,8 раза и в 1,2 раза - при пероральном введении и статистически значимое уменьшение среднего диаметра клетки при внутримышечном введении в 1,5 раза по сравнению с группой без воздействия, что свидетельствовало об атрофических изменениях в клетках.
При этом ядерно-цитоплазматический индекс не менялся при введении экстракта. При окраске по Браше отмечали уменьшение экспрессии ядерной РНК в ткани опухоли крыс, как в группе перорального, так и внутримышечного введения, что возможно говорит о снижении ее транскрипционной активности.
Сравнительный анализ двух различных методов введения экстракта аврана показал, что внутримышечное введение является наиболее эффективным, и сопровождается плавной положительной динамикой снижения роста опухоли, с уменьшением конечного объема опухоли на 40% по сравнению динамикой изменения опухоли в группе сравнения.
При пероральном введении экстракта аврана динамика роста опухоли статистически значимо отличалась только до девяти суток, а к окончанию эксперимента объем опухоли стал приближаться к показателям группы сравнения. Влияние экстракта аврана лекарственного на морфологию опухолевой ткани проявлялся выраженными некробиотическими и атрофическими изменениями в опухолевых клетках. Эти данные подтверждаются также отсутствием митозов и уменьшением экспрессии ядерной РНК, снижением пролиферативной активности клеток, что говорит о снижении синтетической активности ядра и отсутствием активного деления опухолевых клеток. Также при воздействии экстракта отмечали появление признаков апоптоза в опухолевых клетках в виде апоптозных телец. Все описанные изменения были более выражены при внутримышечном пути введения.
Заключение. Экстракт аврана лекарственного в дозе 110 мг/кг/сут при внутримышечном пути введения вызывает торможение роста перевитого рака почки (РА) крыс и приводит к развитию некробиотических и дистрофических процессов в опухолевых клетках, появлению признаков апоптоза, снижению пролиферативной активности клеток и уменьшения ядерной РНК.
Таблица 1. Средняя масса опухоли на конец эксперимента (М±σ)
Группа |
Масса опухоли |
ИТРО (%) |
Группа сравнения |
11,52±2,34 |
0 |
Экстракт аврана в/м |
3,1±1,16 |
73 |
Экстракт аврана per os |
3,29±1,23 |
71 |
Примечание: ИТРО –индекс торможения роста опухоли по массе
Таблица 2. Морфометрические показатели клеток опухоли почки (РА) в контрольной группе и после внутримышечного и перорального введения экстракта аврана
Группа |
Число кл. в п/зр (ув.774) |
Диаметр ядра (мкм) |
Диаметр клетки (мкм) |
ЯЦИ |
Индекс пролиферации |
Группа сравнения |
106,47 ±2,36 |
0,0104 ±0,0003 |
0,0164 ±0,001 |
0,63 ±0,024 |
0,48 ±0,053 |
Экстракт аврана в/м |
52,33 ±4,8* |
0,0062 ±0,0003* |
0,0103 ±0,0005* |
0,61 ±0,031 |
0,000 ±0,0000* |
Экстракт аврана per os |
63,0 ±2,43* |
0,0088 ±0,0009* |
0,0250 ±0,0120 |
0,60 ±0,079 |
0,01 ±0,0001* |
Примечание: * – T>1.96 достоверность различий более 95% между опытной группой и группой сравнения.