Skip to Content

Морфологические изменения перевитого рака почки у крыс при введении флавоноидсодержащего экстракта аврана лекарственного

ID: 2017-02-1276-A-13114
Оригинальная статья (свободная структура)
ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России

Резюме

В экспериментах in vivo проведено исследование противоопухолевой активности экстракта аврана лекарственного при различных способах введениях в дозе 110 мг/кг/сут на протяжении 12 дней у  крыс с перевитым раком почки (PА). Установлено, что внутримышечное введение экстракта является наиболее эффективным, и приводит к замедлению темпов роста опухоли и уменьшению конечного объема опухоли на 40% по сравнению c размерами опухоли у животных без воздействия экстракта. При пероральном введении экстракта также происходит замедление темпов роста опухоли, а к окончанию эксперимента (14 сутки) объем опухоли уменьшается на 23% по сравнению с группой крыс без воздействия. Гистологические изменения в опухолевой ткани были более выражены при внутримышечном введении и проявлялись некробиотическими и атрофическими изменениями в клетках, снижением пролиферативной активности, отсутствием митозов и уменьшением экспрессии ядерной РНК, что может говорить о блокировке синтетических процессов на уровне ядра. Таким образом, наиболее выраженный патоморфоз перевитого рака почки под влиянием экстракта аврана лекарственного наблюдается при внутримышечном пути введения эстракта.

Ключевые слова

флавоноиды, рак почки, экстракт аврана лекарственного, патоморфоз

Статья

Введение. В настоящее время нет ни одного противоопухолевого препарата, который был бы безопасен в рекомендуемых для клинического применения дозах и не имел бы ограничений для использования [1]. Недостатками имеющихся противоопухолевых препаратов являются их токсическое влияние на неизмененные органы и ткани организма и развитие к ним устойчивости опухолей [2]. Это делает необходимым поиск новых, более безопасных и высокоэффективных лекарственных средств.

Особое внимание уделяется созданию лекарственных средств растительного происхождения с минимальными побочными эффектами. Препараты из растительного сырья могут использоваться не только для уничтожения опухолевых клеток, но и защиты нормальных клеток (в том числе, и стволовых клеток костного мозга) при проведении стандартного курса химио- и радиотерапии [1,2,3].

Самой перспективной группой, по мнению ряда авторов, являются флавоноиды, так как обладают наибольшим количеством биологических эффектов, оказывающих положительное влияние на результат лечения новообразований [2,3]. Открытие в 2011 году способности растительного флавоноида вогонина к активации апоптоза в опухолевых клетках [4] позволило продолжить поиск и других биофлавоноидов, обладающих противоопухолевой активностью.

При различных способах извлечений из  цветков и листьев аврана можно получать биологически активные композиции, обладающие различными свойствами: слабительным, рвотным, спазмолитическим, диуретическим, дигиталисоподобным действием на сердце, противовоспалительным, антиоксидантным, иммуномодулирующим, противотуберкулезным и др. [5-9].

Ранее на лабораторных животных с перевитыми опухолями нами было показано, что флавоноидсодержащий экстракт аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.), наряду с малой токсичностью, обладает противоопухолевой активностью в отношении перевиваемого рака печени [10-14]. Исследований противоопухолевого действия экстракта аврана на перевитые опухоли почки у крыс ранее не проводили.

Цель исследования: в экспериментах in vivo исследовать противоопухолевую активность флавоноидсодержащего экстракта аврана лекарственного на модели перевитого рака  почки у крыс.

Материал и методы. Использовали водные растворы экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.), собранного в экологически чистом районе, на острове Чардым Саратовской области. Экстракты были получены нами авторским способом (Патент РФ 2482863), позволяющим существенно повысить выход биофлавоноидов и предусматривающим минимальный выход токсичных соединений (алкалоидов, гликозидов и др.) [15], что особенно актуально при получении нетоксичных экстрактов ядовитых растений, к которым относится авран лекарственный. Ранее в составе травы аврана была описана бетулиновая кислота, обладающая противоопухолевой активностью, но использованная нами технология получения экстракта исключала выход данного соединения [15]. Экстракт, полученный данным способом из аврана лекарственного имеет следующий химический состав: 4-винил-2-метоксифенол; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он; 2,3-дигидробензофуран; 3-фуранкарбоновая кислота; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; этил-a-d-рибозид; 4-пропилфенол; пирокатехин; L-луксоза (пентоза); 6-деоксигексоза L-галактоза; бензоилуксусной кислоты этиловый эфир; гексадекановая кислота (пальмитиновая кислота); гомованилиновая кислота; глюкоза; 1,4-ангидро- d-маннитол; бензойная кислота; кверцетин. Среднее значение кверцетина в данном экстракте с использованием градуировочного графика стандартного образца кверцетина (98%) Sigma, составляет 0,66%. Установленное нами методом жидкостной хроматографии количество кверцетина в сухом остатке экстрактивных веществ (получаемого из 10 г сухой травы аврана) составило 350 мкг [15]. Экстракт получен на Кафедре общей биологии, фармакогнозии и ботаники СГМУ им В.И, Разумовского, вводили животным в виде водного раствора (концентрация экстракта 100 мг/мл ).

Работу с лабораторными животными осуществляли согласно протоколу исследований, не противоречащему Женевской Конвенции 1985 г. о «Международных принципах биомедицинских исследований с использованием животных». Протокол исследований одобрены этической комиссией ФГБОУ ВО СГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава РФ (протокол №13 от 3 мая 2011 г.).

В эксперименте, проведенном в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [17] на базе Центра коллективного пользования НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии СГМУ, было использовано 30 самцов белых лабораторных крыс линии Wistar, массой 150±50 г, которым имплантировали подкожно в области лопатки по 0,5 мл 25% опухолевой взвеси рака почки РА в растворе Хэнкса. Опухоль была получена из банка опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.Н. Блохина.

Животные с перевитым раком почки методом случайной выборки были разделены на три группы по 10 крыс: первую и вторую – опытные, крысы получали экстракт аврана либо перорально, либо внутримышечно в дозе 110 мг сухой массы экстракта/кг/сутки. Третью  группу - сравнения, составили животные с перевитой опухолью, но без введения экстракта. В опытных группах через 72 ч после трансплантации опухоли крысам вводили физиологический раствор ежедневно в течение двух недель, после чего животных всех групп выводили из эксперимента путем декапитации и производили забор образцов ткани опухоли.

Динамику роста опухоли оценивали по изменению ее объема по формуле: V=АхВхС, где А– ширина, В – толщина, С – высота опухоли. Измерения проводили электронным штангенциркулем каждый день от начала эксперимента.  Высчитывали индекс торможения роста опухоли (ИТРО) – показатель эффективности противоопухолевого препарата, вычисляемый по формуле: ИТ= [(Mконтр –Mопыт)/ Mконтр]*100%, где Mконтр – средняя масса опухоли в группе контроль, а Mопыт – опытной группы  (Вычисляется масса опухоли, полученная на конец эксперимента).

Для изучения патоморфоза опухоли применяли морфологические и морфометрические методы с использованием стандартных гистологических методик окраски гематоксилином и эозином, по Романовскому-Гимзе; гистохимические методики: PAS реакция, а также окраска метиловым зеленым пиронином по Браше для выявления ДНК и РНК, иммуногистохимическое окрашивание на маркер пролиферации Ki-67. Индекс пролиферации рассчитывался, как отношение положительно окрашенных клеток (Ki67), к общему количеству клеток в поле зрения. Учитывали наличие дистрофических и некробиотических изменений в опухолевых клетках, а также такие цитоморфометрические показатели, как диаметр опухолевой клетки, диаметр ядра опухолевой клетки, ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ), среднее количество клеток в поле зрения. Подсчет проводили на 100 клеток в 10 полях зрения каждого микропрепарата, с помощью Микровизора медицинского проходящего света µVizo-103 на увеличении 774. При статистической обработке данных нормальность распределения показателей в группах была проверена при помощи критерия Шапиро-Уилка. Для сравнения средних полученных показателей был использован критерий Крамера-Уэлча (Т), при котором разность средних арифметических двух выборок (контрольной и экспериментальной) делится на естественную оценку среднего квадратического отклонения этой разности. При данном методе разность средних с вероятностью в 95% определяется при Т≥1,96. Весь статистический анализ выполнен при помощи программного обеспечения STATISTICA 10.0 Interprise.

Результаты и обсуждение. При внутримышечном введении экстракта аврана отмечали статистически значимое (Т≥1,96) замедление темпов роста перевиваемого рака почки, чем в группе сравнения во все дни измерений. На момент окончания эксперимента объем опухоли в этой группе составил 6.7±0.53 см3 и был на 40 % меньше (Т≥1,96), чем в группе сравнения (11±0.92 см3).

При пероральном ведении экстракта аврана наблюдали замедление темпов роста опухоли (Т≥1,96) по сравнению с крысами группы сравнения с пятого по десятый день  и с двенадцатого по четырнадцатый день введения экстракта. На момент окончания эксперимента объем опухоли в этой группе с составил 8,55±0.26 см3 и был на 23 % меньше (Т≥1,96), чем в группе сравнения (11±0.92 см3). Следует отметить, что  именно в этой группе животных с 9 по 11 день отмечали самый медленный темп прибавки массы опухоли. (Рис.1).

Индекс торможения по массе опухоли составил 71% для перорального введения и 73 для внутримышечного пути введения экстракта аврана лекарственного. (Табл. 1)

Патоморфоз рака почки

При гистологическом исследовании в ткани опухоли под действием аврана обнаружены обширные зоны некроза и дистрофические изменения опухолевых клеток, а также апоптозные тельца (рис. 2б). В группе сравнения (без лечения) встречали фигуры митозов (до 2 в поле зрения), чего не отмечали в опытных группах.

При проведении морфометрии наблюдали статистически значимое снижение среднего числа клеток в поле зрения в два раза при внутримышечном введении и 1,6 раза при пероральном введении (табл. 2).

Выявили уменьшение размеров диаметра ядра при внутримышечном введении в 1,8 раза и в 1,2 раза -  при пероральном введении и статистически значимое уменьшение среднего диаметра клетки при внутримышечном введении в 1,5 раза по сравнению с группой без воздействия, что свидетельствовало об атрофических изменениях в клетках.

При этом ядерно-цитоплазматический индекс не менялся при введении экстракта. При окраске по Браше отмечали уменьшение экспрессии ядерной РНК в ткани опухоли крыс, как в группе перорального, так и внутримышечного введения, что возможно говорит о снижении ее транскрипционной активности.

Сравнительный анализ двух различных методов введения экстракта аврана показал, что внутримышечное введение является наиболее эффективным, и сопровождается плавной положительной динамикой снижения роста опухоли, с уменьшением конечного объема опухоли на 40% по сравнению динамикой изменения опухоли в группе сравнения.

При пероральном введении экстракта аврана динамика роста опухоли статистически значимо отличалась только до девяти суток, а к окончанию эксперимента объем опухоли стал приближаться к показателям группы сравнения. Влияние экстракта аврана лекарственного на  морфологию опухолевой ткани проявлялся выраженными некробиотическими и атрофическими изменениями в опухолевых клетках. Эти данные подтверждаются также отсутствием митозов и уменьшением экспрессии ядерной РНК, снижением пролиферативной активности  клеток, что говорит о снижении синтетической активности ядра и отсутствием активного деления опухолевых клеток. Также при воздействии экстракта отмечали появление признаков апоптоза в опухолевых клетках в виде апоптозных телец. Все описанные изменения были более выражены при внутримышечном пути введения.

Заключение. Экстракт аврана лекарственного в дозе 110 мг/кг/сут при внутримышечном пути введения вызывает торможение роста перевитого рака почки (РА) крыс и приводит к развитию некробиотических и дистрофических процессов в опухолевых клетках, появлению признаков апоптоза, снижению пролиферативной активности клеток и уменьшения ядерной РНК.

Литература

  1. Корман Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии. Москва: Практическая медицина, 2014.
  2. Корсун В.Ф., Корсун Е.В., Лахтин В.М., Фитолектины: руководство по клинической фитотерапии. Москва: Практическая медицина, 2007.
  3. Гольдберг Е.Д., Разина Т.Г., Зуева Е.П. и др. Растения в комплексной терапии опухолей. Москва: Издательство РАМН, 2008.
  4. Polier, Ding, Konkimalla, et al., Wogonin and related natural flavones are inhibitors of CDK9 that induce apoptosis in cancer cells by transcriptional suppression of Mcl-1.//Cell Death Dis. 2011. №2. P. e182
  5. Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Тычина С.А., Корчаков Н.В.
    Изменения лейкоцитарной формулы, красного костного мозга и опухоли лабораторных крыс с перевитой саркомой-45 при введении экстрактов аврана лекарственного, бессмертника песчаного, кукурузы антациановой. //Саратовский научно-медицинский журнал.  2015. Т. 11. № 3. С. 328-332.
  6. Наволокин Н.А., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н. и др., Противоопухолевая активность растительных экстрактов, содержащих биофлавоноиды.// Российский биотерапевтический журнал. 2013 Т.12 . №2. С. 59-59a.
  7. Наволокин Н.А., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н. и др., Морфология внутренних органов и опухоли лабораторных крыс с перевитым раком печени РС-1 при пероральном введении флавоноидсодержащих экстрактов аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.) и кукурузы антоциановой (Zea mays l.)  //Саратовский научно-медицинский журнал. 2013. Т.9. №2. С.213-220.
  8. Наволокин Н.А., Скворцова В.В., Полуконова Н.В. и др. Противотуберкулезная активность экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.) In vitro. // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2015. Т. 78. №4. С.10-13.
  9.  Полуконова Н.В.,  Наволокин Н.А.,  Райкова С.В. и др., Противовоспалительная, жаропонижающая и антимикробная активность флаваноидсодержащего экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.). Экспериментальная и клиническая фармакология. 2015. –Т.-78. - №1, С.34 -38
  10. Наволокин Н.А., Павлова А.В. Морфологические изменения в мышцах у лабораторных крыс и определение токсичности при введении экстракта аврана // Бюллетень медицинских интернет-конференций.  2012. Т. 2. № 2. С. 82.
  11. Полуконова А.В., Наволокин Н.А., Бибикова О.А. Цитотоксическая активность in vitro экстракта аврана на культуре клеток почек эмбрионов свиньи, зараженных онковирусом. // Бюллетень медицинских интернет-конференций.  2013.Т.3. № 2. С.375.
  12. Наволокин Н.А., Полуконова А.В., Бибикова О.А. и др. Цитоморфологические изменения в культуре клеток почки эмбриона свиньи при воздействии экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.). //Фундаментальные исследования. 2014. №10-17. С. 1369-1374.
  13. Скворцова В.В., Наволокин Н.А. Патоморфоз саркомы s45 при внутримышечном введении флавоноидсодержащего экстракта лабораторным крысам//Бюллетень медицинских интернет-конференций. 2013. Т.3. 2. С. 258.
  14. Polukonova N.V., Kurchatova M.N, Navolokin N.A., et al. A new extraction method of bioflavanoids from poisonous plant (Gratiola officinalis l.). //Russian Open Medical Journal. 2014. V3. 3. P. 304.
  15. Полуконова Н.В., Дурнова Н.А., Курчатова М.Н., Наволокин Н.А. Химический анализ и способ получения новой билогически активной композиции из травы аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.). //Химия растительного сырья.  2013.  №4. C.165–173.
  16. Boryczka, Bebenek, Jastrzebska etc., Crystal structure of betulinic acid-DMSO solvate. Crystalline Materials. – 2012. – V.227. - №6. – pp. 379-384
  17. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д., Васильев А.Н., Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. Москва: Гриф и К, 2012.

Таблицы

Таблица 1. Средняя масса опухоли на конец эксперимента (М±σ)

Группа

Масса опухоли

ИТРО (%)

Группа сравнения

11,52±2,34

0

Экстракт аврана в/м

3,1±1,16

73

Экстракт аврана per os

3,29±1,23

71

Примечание: ИТРО –индекс торможения роста опухоли по массе

Таблица 2. Морфометрические показатели клеток опухоли почки (РА) в контрольной группе и после внутримышечного и перорального введения экстракта аврана

Группа

Число кл. в п/зр (ув.774)

Диаметр ядра

(мкм)

Диаметр клетки (мкм)

ЯЦИ

Индекс пролиферации

Группа сравнения

106,47

±2,36

0,0104

±0,0003

0,0164

±0,001

0,63

±0,024

0,48

±0,053

Экстракт аврана в/м

52,33

±4,8*

0,0062

±0,0003*

0,0103

±0,0005*

0,61

±0,031

0,000

±0,0000*

Экстракт аврана per os

63,0

±2,43*

0,0088

±0,0009*

0,0250

±0,0120

0,60

±0,079

0,01

±0,0001*

Примечание: * –  T>1.96 достоверность различий более 95% между опытной группой и группой сравнения.

Рисунки

Рисунок 1. Динамика роста рака почки (РА), привитого крысам в группе сравнения и группах с пероральным и внутримышечным введением водного раствора экстракта аврана лекарственного. Примечание: * T>1.96 достоверность различий более 95% при анализе значений группы с пероральным введением и группой сравнения. + - T>1.96 достоверность различий более 95% при анализе значений группы с внутримышечным введением и группой сравнения.
Рисунок 2. Морфологические изменения в перевитом раке почки. А – контрольная группа, H&E; Б – дистрофические и некротические изменения, апоптозные тельца, при в/м введении экстракта аврана, H&E; В – контрольная группа, окраска по Браше; Г –снижение экспрессии окраски на ДНК при в/м введении экстракта аврана, окраска по Браше; Д – ядерная экспрессия Ki67 клеток рака почки в контроле; E – отсутствие экспрессии Ki67 при в/м введении экстракта аврана, апоптозные тельца. Ув. х774.
0
Ваша оценка: Нет



Оптимальный хостинг для Drupal, Wordpress, Joomla, Битрикс и других CMS, быстрые и надежные сервера, круглосуточная техподдержка Яндекс.Метрика