ФАГОЦИТОЗ И ХОНДРОПТОЗ В ХРЯЩЕ (дискуссии, поиски, гипотезы) БЕНГУС Л.М. ГУ «Институт патологии позвоночника и суставов им. проф. М.И. Ситенко НАМН Украины», г. Харьков, Украина PHAGOCYTOSIS AND CHONDROPTOSIS IN A CARTILAGE (discussions, search, hypotheses) BENGUS L.M. Sitenko Institute of Spine and Joint Pathology, Ukraine Academy of medical science, Kharkov, Ukraine

Современные представления о структуре хрящевой ткани базируются на главном постулате, который гласит, что суставной хрящ является аваскулярной структурой, клеточный состав его представлен хондробластами (слабо дифференцированными хрящевыми клетками) и хондроцитами (дифференцированными хрящевыми клетками, специализированными в отношении биосинтеза и секреции компонентов хрящевого матрикса).

Однако развитие современной науки позволяет открывать неизвестные и малоизвестные страницы в «судьбе» хряща. В хряще не имеется доказательства присутствия «профессиональных фагоцитов» – моноцит-производных макрофагов и нейтрофилов. Различные исследователи [1‒3] показали возможность неспециализированных в отношении фагоцитоза клеток ‒ фибробластов, гломерулярных мезангиальных клеток, эндотелиальных клеток и даже хондроцитов приобретать способность к фагоцитозу апоптотических клеток in vivo [1], при отсутствии коммитированных макрофагов. С помощью флюоресцентной микроскопии и микроскопического видеонаблюдения было показано, что культивированные клетки студенистого ядра, выделенные из каудальных межпозвонковых дисков быка [4,5], фагоцитировали добавленные в культуральную среду частицы латекса. Отмечено, что клетки студенистого ядра фагоцитировали большее количество частиц латекса, чем со-культивируемые специализированные фагоциты. Возможно, это обусловлено их большими размерами, чем таковые у коммитированных фагоцитов. Кроме того, при совместном культивировании в монослойной культуре хондроцитов диска и опухолевых клеток HeLa с ультрафиолет-индуцированным апоптозом хондроциты студенистого ядра приобретали способность фагоцитировать апоптотические клетки.

На основании этого авторы делают вывод о том, что апоптотические клетки диска, присутствующие в нем in vivo на этапах его дегенерации и в грыжах диска, посылают сигналы посредством экспрессии рецепторов фагоцитоза, которые стимулируют процессы фагоцитоза в жизнеспособных хондроцитах диска. В англоязычной научной литературе эти сигналы, посылаемые апоптотическими клетками, образно называют «eat me» – «съешь меня». Они включают карбогидратные изменения поверхности апоптотических клеток, активацию на ней тромбоспондин- и фосфатидилсерин-связывающих участков [1]. Известно, что в дегенеративно измененном межпозвонковом диске и суставном хряще хондроциты нередко формируют кластеры, которые содержат клетки в разных функциональных состояниях. В связи с этим, становится понятным способ воздействия апоптотических клеток на жизнеспособные клетки с помощью цитокинов, и обусловленная этим трансформация биосинтеза и фенотипа хондроцитов, переключающих свой метаболизм с хондропластического на хондрокластический. У коммитированных фагоцитов триггером фагоцитоза является молекула фосфатидилсерина, экспрессирующегося на наружной мембране апоптотических клеток. Фосфатидилсерин связывается с рецепторами клеточной гибели (CD14, CD36, CD68). Молекулярный каскад, имеющий место у факультативных фагоцитов, к которым относятся хондроциты межпозвонкового диска и суставного хряща, изучен недостаточно [2, 6].

Существует мнение, что важную роль в активизации факультативных фагоцитов и вовлечении их в фагоцитоз апоптотических клеток играют лектины [1]. В исследованиях [4, 7] были получены убедительные доказательства того, что клетки студенистого ядра диска могут вести себя как фагоциты и при соответствующих условиях подвергаться фагоцитозу (апоптотические хондроциты). Клетки студенистого ядра межпозвонкового диска людей с дегенерацией диска (но без наличия грыжи) имеют положительную иммуногистохимическую окраску на гликопротеин CD68 (Cluster of Differentiation-68) [7], который является маркером моноцитов и макрофагов [8]. Эти клетки не являются специализированными макрофагами или моноцитами, которые внедрились в диск, но они представляют собой трансформированные резидентные клетки, которые могут вовлекаться в процесс фагоцитоза внеклеточного матрикса. Хондроциты других хрящевых тканей, например, суставного [3] или эпифизарного хряща [9] также могут становиться факультативными фагоцитами. Суспензия хондроцитов из суставного хряща коленного сустава была культивирована для оценки фагоцитоза латексных частиц, размером 1 мм, детрита суставного хряща, некротических и апоптотических остатков клеток (размером 1 мк). С помощью конфокальной микроскопии и жидкостной цитометрии было выявлено, что хондроциты фагоцитировали частицы латекса. Методами светлопольной и трансмиссионной электронной микроскопии было установлено, что хондроциты суставного хряща in vitro фагоцитировали тканевой детрит и клетки с вепезид-16-индуцированным (VP-16 – индуктор апоптоза раковых клеток) апоптозом и некрозом [3].

Таким образом, было доказано наличие у хондроцитов способности к фагоцитозу, что подтверждает идею о том, что фагоцитоз, осуществляемый хондроцитами, расположенными вблизи погибших клеток, возможен, но это явление очень редкое. В суставном хряще и межпозвонковых дисках человека механизм активации фагоцитарных и аутолитических свойств у хондроцитов необходим для удаления апоптотических клеток, количество которых неуклонно растет с возрастом.

В тех случаях, когда собственных резервов хондроцитов, специализирующихся на элиминации погибших путем апоптоза клеток, недостаточно, имеет место активизация вторичного некроза с последующим повреждением клеточного микроокружения [10], что, по-видимому, стимулирует воспалительную реакцию в прилежащих тканях. Повышение частоты и темпов апоптоза хондроцитов, их способность при необходимости трансформироваться в факультативные фагоциты, а также активизация воспалительной реакции в ответ на вторичный некроз являются важными элементами проявления адаптационно-компенсаторных механизмов организма в ответ на дегенерацию хряща.

В последние годы стали накапливаться доказательства того, что программируемая гибель клеток не всегда проявляется как классический апоптоз [9, 11, 12]. Оказалось, что клетки имеют различные пути, с помощью которых они подвергаются гибели (табл. 1), и эти пути характеризуются различной морфологией. Таблица 1. Варианты гибели клеток по J.B. Kouri [11] И хотя апоптоз культивированных хондроцитов имеет характерные классические морфологические и биохимические признаки (сжатие и сморщивание клетки, конденсация хроматина и вовлечение каскада каспаз) [13], такие клетки очень редко встречаются в хряще in vivo. Была сделана попытка установить морфологические различия между способом гибели хондроцитов и классическим апоптозом клеток. С этой целью был предложен термин «хондроптоз» [9, 11, 12] для характеристики другого ‒ не классического апоптоза хондроцитов суставного и эпифизарного хряща, который является специфической формой программируемой гибели хондроцитов in vivo.

В отличие от классического апоптоза, у хондроцитов, вставших на путь «хондроптоза», вначале происходит гиперплазия комплекса Гольджи и мембран эндоплазматической сети (ЭПС), что отражает усиление синтеза белка. Но при этом в хондроцитах, очевидно, синтезируются не белки хрящевого матрикса, а протеолитические ферменты. Гиперплазированные мембраны ЭПС сегментируют цитоплазму и способствуют образованию компартментов клетки, внутри которых происходит ферментативное расщепление цитоплазмы и органелл хондроцита. Имеет место деструкция материала внутри аутофагосом, присутствуют остаточные тельца, а в хрящевых лакунах выявляются клеточные остатки в виде пузырьков. Вместе взятые эти процессы приводят к полной самодеструкции хондроцита, на что указывает присутствие в хряще пустых лакун.

Полагают, что ЭПС-зависимый путь апоптоза играет более значительную роль в хондроптозе, чем рецептор-опосредованный или митохондриальный пути и что лизосомальные протеазы так же важны для клеточной гибели, как и каспазы. В связи с тем, что хондроптоз не зависит от фагоцитоза, он может быть более предпочтительным in vivo, где хондроциты изолированы внутри своих лакун. Однако инициирующие факторы и молекулярные пути, вовлекающие хондроциты в хондроптоз, пока остаются неясными. При электронно-микроскопическом исследовании глубокой зоны эпифизарного хряща кроликов не было обнаружено признаков апоптоза хондроцитов, хотя такие клетки были обнаружены in vitro. Вместо этого были выявлены электронно-плотные хондроциты с лопастным ядром, очаговой конденсацией хроматина и темной цитоплазмой с обильным количеством канальцев ЭПС [14]. Эти клетки авторы назвали «темными хондроцитами».

Детальное исследование их ультраструктуры в сочетании с иммуно-гистохимическими методами показало наличие другого механизма программируемой гибели этих клеток. Кроме того, в незрелых хондроцитах хрящевых эпифизов также были идентифицированы другие типы гибели клеток. Эти клетки имели такие же ядра как у «темных хондроцитов», канальцы ЭПС были расширены и заполняли все внеядерное пространство клетки, при этом другие органеллы были редуцированы, а цитоплазма содержала плотные извитые включения. Эти клетки авторы назвали ослабленными или «парализованными». Было сделано предположение, что «темные хондроциты» и «парализованные» клетки являются примером физиологической гибели клеток, отличной от апоптоза. Учитывая то, что фагоцитоз апоптотических телец хондроцитов, заключенных в свои лакуны, явление редкое, необходим другой механизм их элиминации [14]. В исследованиях R.A. González-Polo и соавт. (2005) [15] было доказано, что митохондриально-зависимой активации каспаз и апоптотическим изменениям ядра предшествует аутофагическая вакуолизация цитоплазмы.

Это объединило два типа клеточной гибели: 1-й тип ‒ классический апоптоз и 2-й тип, характеризующийся аккумуляцией аутофагических вакуолей в цитоплазме [10, 16‒18]. При остеоартрозе хондроциты суставного хряща содержат вакуоли с поглощенными небольшими частицами и волокнами (продуктами деструкции матрикса), что может быть связано с фагоцитозом хондроцитов. При сравнении остеартрозного суставного хряща человека и крыс (на поздней стадии экспериментального остеоартроза) были получены сходные результаты, которые впоследствии были дополнены ультраструктурными и иммуногистохимическими наблюдениями. Исследования были направлены на выяснение роли комплекса Гольджи, который играет важную роль в процессе апоптоза хондроцитов при остеоартрозе. Однако особенности влияния комплекса Гольджи на апоптоз в суставном хряще человека при остеоартрозе не установлены. При оценке интенсивности метки белка-58К (Golgi 58K protein) ‒ иммунологического маркера комплекса Гольджи, и маркеров апоптоза (TUNEL и каспаза-2L) в суставном хряще больных остеоартрозом после тотальной артропластики колена было обнаружено значительное усиление метки Гольджи-белка в хондроцитах.

Иммуногистохимический анализ показал со-локализацию белка комплекса Гольджи 58К и каспазы-2L, что свидетельствует о том, что данный фермент присутствует в комплексе Гольджи хондроцитов при остеоартрозе. Это подтвердило роль комплекса Гольджи в апоптозе, и то, что индуцирующие апоптоз каспазы локализуются в комплексе Гольджи. Кроме того, было обнаружено множество TUNEL-положительных хондроцитов, но при этом имели место различные соотношения клеток в плане каспазы-2L. Эти данные подтвердили ранее предложенную концепцию о том, что апоптоз в хряще при остеоартрозе (хондроптоз) может являться вариантом классического апоптоза [12]. Эти результаты согласуются с данными H.I. Roach (2004) [9] об участии комплекса Гольджи в гибели хондроцитов путем хондроптоза. Изменение хрящевых клеток при остеоартрозе связано с нарушением метаболизма хондроцитов ‒ подавлением биосинтеза протеогликанов и коллагена и повышением продукции молекул, деградирующих хрящевой матрикс (матриксных металлопротеиназ, в частности – ММР-13), превышающим биосинтез ингибиторов протеаз [19, 20].

Удаление апоптотически измененных хондроцитов при остеоартрозе происходит с помощью как апоптотических, так и не апоптотических сигналов [21]. Была сделана попытка установить последовательность событий, которые имеют место в процессе элиминации хондроцитов при остеоартрозе. С этой целью у животных с моделью остеоартроза была проведена идентификация апоптоза (иммуногистохимическими методами по определению активности каспаз и с помощью TUNEL-метки) и аутофагии (с помощью маркеров аутофагии ‒ LC3II ‒ легкая цепь связанного с микротрубочками белка, и маркеров цитоплазматической вакуолизации).

Была показана модификация процесса гибели хондроцитов в разных зонах хряща. На ранней стадии остеоартроза гибель хондроцитов начиналась с апоптоза в поверхностной и части промежуточной зоны хряща, вероятно, как следствие постоянной механической травматизации сустава. С течением дегенеративного процесса в хондроцитах тех же зон суставного хряща была обнаружена высокая частота активации каспазы-3 и LC3II-экспрессия, что указывало на комбинацию двух процессов гибели клеток – апоптоза и аутофагии. В глубокой зоне хряща, на фоне аномальной оссификации субхондральной кости, имеющей место при остеоартрозе, наблюдался только апоптоз.

В наших исследованиях при изучении ультраструктурной организации суставного хряща у животных с экспериментальным глюкокортикоид-индуцированным остеоартрозом [22, 23] мы наблюдали активизацию апоптоза хондроцитов (рис. 1), что было подтверждено методом трансмиссионной электронной микроскопии. В таких хондроцитах выявлялась значительная гетерохроматизация и нередко фрагментация клеточного ядра. При этом в цитоплазме хондроцитов обнаруживалось обилие вакуолей.

В других клетках на фоне лопастного гетерохромного ядра в цитоплазме определялись гипертрофированная ЭПС и комплекс Гольджи, что соответствует морфологическим признакам хондроптоза (рис. 2). Изредка вблизи апоптотически измененного хондроцита (в одной хрящевой лакуне) мы обнаруживали другой хондроцит с признаками активизации фагоцитоза (рис. 3). Такие хондроциты имели гипертрофированные удлиненные клеточные отростки, которые были направлены в сторону расположенной поблизости погибшей клетки. Ядро таких клеток было преимущественно лопастным с высокой долей гетерохроматина. Нередко такой хондроцит содержал в цитоплазме крупную фагосому с деструктивно измененным хрящевым матриксом либо погибшим хондроцитом, на что указывало присутствие в фагоцитированной клетке клеточных отростков, остаточных телец и фрагментов мембранных органелл. При этом в цитоплазме фагоцитирующего хондроцита сохранялась достаточно хорошо развитая агранулярная ЭПС.

Согласно характеристике клеточной гибели у хондроцитов in vivo [9, 11, 12] наличие в цитоплазме развитой ЭПС, на фоне активизации фагоцитарной активности клетки, является одной из стадий хондроптоза. Т.е., фагоцитирующие хондроциты, по-видимому, с одной стороны, участвуют в процессе очищения матрикса от продуктов тканевого и клеточного детрита, а с другой стороны, они сами уже находятся на начальной стадии гибели клетки. Изредка мы обнаруживали в промежуточной зоне суставного хряща клетки с нетипичной для хрящевой ткани ультраструктурой. Эти клетки были отростчатые, по форме напоминали фибробласты, но их цитоплазма содержала многочисленные вариабельные по размерам вторичные лизосомы. Кроме того, некоторые из этих клеток содержали 2-3 ядра.

Ультраструктура таких клеток дает нам повод сделать предположение о том, что они являются клетками с кластическими функциями, которые можно отнести к хондрокластам (при наличии нескольких ядер), либо к факультативным макрофагам (при выраженной фагоцитарной активности). Следует отметить, что вопрос утилизации погибших путем апоптоза хондроцитов в настоящее время в научной литературе является слабо освещенным. Некоторые авторы считают, что образовавшиеся в процессе апоптоза апоптотические тельца подвергаются дальнейшей деградации в хрящевом матриксе, а продукты их распада могут поступать путем диффузии в полость сустава, вызывая, таким образом, асептическое воспаление и индуцируя остеоартроз [24].

На основании наших наблюдений мы можем предположить, что в суставном хряще имеется и другой путь утилизации погибших путем апоптоза клеток и продуктов их распада. Этот путь связан с передачей сигнала от апоптотически погибшего хондроцита к жизнеспособному хондроциту, расположенному в пределах одной с ним лакуны, либо в кластере хондроцитов, либо (при отсутствии таковых) ‒ в территориальном или интертерриториальном матриксе. Погибшая клетка индуцирует сигнал о необходимости переключения метаболизма жизнеспособного хондроцита с хондропластического на хондрокластический. Необходимо отметить, что данный механизм активизируется в патологических ситуациях, связанных с массовой гибелью хондроцитов (при активизации патологического апоптоза), и, возможно – в процессе хондрогенеза. В интактном суставном хряще его проявления слабо выражены в связи с редкими случаями физиологической гибели хондроцитов. Учитывая имеющиеся в современной литературе данные о возможности передвижения хондроцитов в хрящевом матриксе [25] становится понятным, каким образом хрящевые клетки, расположенные на расстоянии друг от друга и не контактирующие своими отростками, могут взаимодействовать, обмениваться сигнальными молекулами и регулировать свой метаболизм, с целью компенсации структурных и функциональных нарушений. Следует отметить, что для обеспечения передвижения хондроцитов в хрящевом матриксе цитоплазма этих клеток содержит цитоскелет, который (при активизации движения клетки, митотическом делении либо на фоне инволютивных изменений) может быть гипертрофированным. Движение хондроцитов обеспечивается массовым сокращением микрофиламентов, а направление движения определяется наличием погибшей клетки и соответствующей ориентацией микротрубочек.

Выводы:

1. Доказано наличие у хондроцитов способности к фагоцитозу. Фагоцитоз, осуществляемый хондроцитами, расположенными вблизи погибших клеток, возможен, но встречается редко.

2. Хондроциты являются не специализированными, а факультативными макрофагами. В этом случае они представляют собой трансформированные резидентные клетки, способные вовлекаться в процесс фагоцитоза внеклеточного матрикса и погибших клеток.

3. В суставном хряще и межпозвонковых дисках человека и животных механизм активации фагоцитарных и аутолитических свойств у хондроцитов необходим для элиминации апоптотических клеток.

4. Апоптоз хондроцитов in vivo – хондроптоз, сопровождается гиперплазией эндоплазматической сети, комплекса Гольджи и обилием аутофагических вакуолей в цитоплазме хондроцитов.

5. Комплекс Гольджи играет важную роль в процессе апоптоза хондроцитов при остеоартрозе. Иммуногистохимически доказано, что индуцирующие апоптоз каспазы локализуются в комплексе Гольджи. Апоптоз в хряще при остеоартрозе (хондроптоз) является вариантом классического апоптоза.

6. При прогрессировании дегенеративного процесса в хондроцитах на фоне остеоартроза имеет место комбинация двух процессов гибели клеток – апоптоза и аутофагии.

Подписи к рисункам

Рис. 1. Модель глюкокортикоид-индуцированного остеоартроза. Апоптоз хондроцита промежуточной зоны суставного хряща. Выраженная гетерохроматизация ядра (стрелка) и вакуолизация цитоплазмы (две стрелки). Контрастирование по Рейнольдсу. Увеличение - х4500. Электронограмма Бенгус Л.М.

Рис. 2. Модель глюкокортикоид-индуцированного остеоартроза. Изогенная группа из двух хондроцитов промежуточной зоны суставного хряща. Снизу – хондроптоз хондроцита. Интенсивно гетерохроматизированное лопастное ядро (стрелка). Гипертрофия комплекса Гольджи – обилие секреторных пузырьков (две стрелки). Агранулярная ЭПС (двойная стрелка). Контрастирование по Рейнольдсу. Увеличение - х8000. Электронограмма Бенгус Л.М.

Рис. 3. Суставной хрящ крысы с глюкокортикоид-индуцированным остеоартрозом. Изогенная группа из 2-х хондроцитов. Сверху – погибший хондроцит (стрелка). Снизу – фагоцитирующий хондроцит. Множество канальцев агранулярной ЭПС (двойная горизонтальная стрелка) и комплекс Гольджи (две стрелки) в цитоплазме хондроцита. Большая фагосома с клеточным детритом (двойная вертикальная стрелка). Экзоцитоз содержимого остаточного тельца (угловая стрелка). Контрастирование по Рейнольдсу. Увеличение - х8000. Электронограмма Бенгус Л.М.