Резюме

В работе рассматривается чувствительность трех представителей рода Staphylococcus к комплексному действию лазерного инфракрасного (808 нм) излучения и двух модификаций красителя индоцианинового зеленого.

Введение

Краситель индоцианиновый зеленый активно используется в самых различных областях медицины: онкологии, офтальмологии, кардиологии, хирургии, дерматологии, в косметологии. Важным является также очень низкая токсичность и быстрое выведение данного красителя из организма [1,2].

Индоцианиновый зеленый является перспективным красителем для применения в фотодинамической терапии, поскольку его максимум поглощения находится в пределах от 780 до 850 нм, что соответствует максимуму испускания инфракрасных лазеров [3].

Механизм угнетающего действия индоцининового зеленого не достаточно изучен. По мнению разных авторов, данный краситель обладает достаточно сильным фототоксическим действием, что можно отнести за счет его фотодинамического эффекта [2-5] или образования цитотоксических конечных продуктов под действием света [6].

Представляло интерес оценить антимикробную эффективность двух модификаций индоцианового зеленого при воздействии лазерного инфракрасного (808 нм) излучения на стафилококки. 

Материалы и методы

В работе использовали две модификации красителя индоцианина зеленого (Sigma-Aldrich Co., USA) с максимумами поглощения на длинах волн 775 нм (ИЗ-775) и 800 нм (ИЗ-800) соответственно. Для экспериментов были выбраны концентрации красителей 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1%.

В качестве модельных микроорганизмов были выбраны: Staphylococcus aureus 209P, S.epidermidis (метициллин-чувствительный (MS) и метициллин-устойчивый (MR) штаммs). Микроорганизмы были получены из коллекции Государственного Института Стандартизации и Контроля им. Л.А. Тарасевича и Саратовского государственного медицинского университета. Бактерии выращивали при температуре 37 °С на универсальной плотной питательной среде (ГРМ-агар, Оболенск, Россия).

В качестве источника инфракрасного излучения применяли диодный лазер с максимумом спектра испускания λ=808±15 нм, плотностью мощности излучения – 60 мВт/см². Во всех экспериментах использовали непрерывный режим излучения. Время облучения составляло от 5 до 30 мин.

Бактериальную взвесь готовили в стерильном физиологическом растворе до конечной концентрации 10³ мк/мл. Из разведения микроорганизмов 10⁵ мк/мл 0.1 мл взвеси вносили в 0.9 мл раствора красителя, инкубировали в течение 15 мин без доступа света. Из конечного разведения, а также из раствора фотосенсибилизатора бактериальну взвесь в объеме 0.1 мл вносили в ячейки планшета.

Источник излучения располагали над ячейками планшета; воздействие проводили последовательно увеличивая время облучения. После воздействия взвеси бактерий переносили на чашки Петри с плотной питательной средой и равномерно распределяли по поверхности стерильным шпателем. Учет результатов проводили путем подсчета числа колониеобразующих единиц (КОЕ) через 24 – 72 часа после инкубации при 37ºС. Контролем служили взвеси бактерий не обработанные сенсибилизатором и не подвергнутые облучению.

Результаты

На первом этапе исследований оценивали чувствительность модельных микроорганизмов к действию различных концентраций ИЗ-775 и ИЗ-800 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1% по изменению числа КОЕ (табл. 1).

Установлено, что оптимальными концентрациями используемых веществ, которые вызывают наименьшую гибель микроорганизмов, являются 0.001% для ИЗ-775 и 0.0001% для ИЗ-800.

Исходя из полученных данных, на следующем этапе работы использовали длительность предварительной инкубации бактериальных клеток с наночастицами, равную 15 мин, экспозицию излучения 5, 10, 15 и 30 мин. В качестве фотосенсибилизаторов использовали две модификации индоцианина зеленого: ИЗ-775 с концентрацией 0.001%, ИЗ-800 с концентрацией 0.0001%.

Установлено, что инфракрасное лазерное излучение незначительно подавляет рост микроорганизмов. Для всех исследованных штаммов снижение числа КОЕ отмечено в пределах от 10 до 35% при варьировании времени облучения от 5 до 30 мин.

Сходный характер подавления роста микроорганизмов ИК-излученим в сочетании с обработкой клеток ИЗ-775 отмечен для S. aureus 209 P и S. epidermidis MS (рис. 1, 2). Уменьшение показателя КОЕ происходило примерно на 40 – 85%. Метициллин-устойчивый штамм эпидермального стафилококка был более подвержен фотодинамическому воздействию ИК-излучения и красителя ИЗ-775. Сокращение числа КОЕ показано на 65 – 87% по сравнению с контролем (рис. 3).

Наибольшую устойчивость к воздействию ИК-излучения в сочетании с красителем ИЗ-800 продемонстрировал S. aureus 209 P (рис. 1). Снижение показателя КОЕ по сравнению с контролем отмечено на 30 – 65%. Для двух штаммов S. epidermidis была установлена сходная тенденция в чувствительности к фотодинамическому воздействию ИК-излучения и красителя ИЗ-800. Сокращение числа КОЕ выявлено на 40 – 87% (рис. 2, 3).

Таким образом, использованные в работе модификации индоцианина зеленого являются эффективными фотосенсибилизаторами при фотодинамическом воздействии инфракрасного лазерного излучения с длиной волны 808 нм на стафилококки. При малой длительности облучения (5-10 мин) большей подавляющей способностью обладал индоцианин зеленый с длиной волны 775 нм. Сокращение численности бактерий, обработанных как ИЗ-775, так и ИЗ-800, после 30 мин воздействия инфракрасного лазерного излучения имело сходный уровень для всех исследованных штаммов (в среднем 85%).