Skip to Content

Способ автоматизированного вычисления площади хрящевой ткани на микропрепаратах образцов бедренной кости при костной имплантации скаффолдов

ID: 2019-05-25-A-18739
Оригинальная статья (свободная структура)
ФГБОУВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России

Резюме

Произведена костная имплантация PCL+CaCO3-скаффолдов в диафиз бедренной кости белым крысам-самцам. Для подсчета площади хрящевой ткани использовались микропрепараты поперечного среза диафиза бедренной кости, окрашенные гематоксилином и эозином («Биовитрум», Россия). С помощью программного инструментария OpenCV была разработана методика автоматизированного анализа микрофотографий позволяющая распознавать области хрящевой ткани, расположенные по периферии от кортикальной пластинки и в костномозговой полости.

Ключевые слова

Цифровая микроскопия, искусственное зрение, распознание, скаффолды, регенерация, хрящевая ткань.

Статья

Введение. В современной медицине выделяют такую актуальную проблему, как стимуляция регенерации поражённых, утраченных или измененных участков тканей. Для решения этой проблемы созданы специальные трехмерные пористые матрицы, которые имплантируются непосредственно в область дефекта в поврежденный участок [1]. 

Скаффолды должны обладать биосовместимостью, а сроки биодеградации имплантатов в организме должны быть сопоставимы со сроками восстановления поврежденного участка.

При создании скаффолдов редко используют один материал, зачастую используют вещества природного и синтетического происхождения в комплексе. В результате чего получают многокомпонентные скаффолды [2]. 

Внедрение в практическую медицину данного метода регенерации тканей требует тщательных доклинических исследований, одним из важных этапов которых представляет имплантация в костную ткань ПКЛ-матриц, минерализованных ватеритом, для проверки остеоиндуктивных свойств скаффолдов. Одной из частных практических задач при этом является оценка интенсивности процесса остеогенеза, а именно интенсивности формирования костных балок, с помощью расчета их площади в микрофотографиях.

Целью:эксперимента являласьоценка процесса регенерации костной ткани при замещении дефекта бедренной кости у белых крыс скаффолдом из поликапролактона (ПКЛ) и ватерита (СаСО3) с помощью подсчета площади костных балок.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования выполнены на 10 белых нелинейных крысах-самцах массой 200-260 г. Для имплантации использовали матрицы на основе поликапролактона (ПКЛ), минерализованные ватеритом (СаСО3) по методике, описанной в работе [3].

С целью достижения наркоза экспериментальным животным за 5 минут до проведения оперативного вмешательства внутримышечно вводились комбинация телазола («Zoetis Inc», США) в дозе 0,1 мл/кг и ксилазина («Interchemie», Нидерланды) в дозе 1 мг/кг. 

Через 28 дней животные были выведены из эксперимента путем передозировки препаратов наркоза.

Анализ препаратов проводили с помощью медицинского микровизора проходящего света mVizo-103 (ОАО «ЛОМО», Россия). При этом использовались объективы с увеличением х5, х20 и камера разрешением 640x768 пикселей. Область зрения, при этом, составляла 1,9661 и 0,1361 мм2соответственно.

Компьютерный анализ микрофотографий. Для разработки последовательности действий, необходимых для автоматического подсчета площади хрящевой ткани, которая образуется по периферии бедренной кости, использовалась фотография микропрепарата поперечного среза диафиза бедренной кости с имплантированным PCL+CaCO3-скаффолдом, полученная x20 объективом. 

Программный анализ микрофотографий включал следующие этапы:

1 этап -изображение микропрепарата преобразовывалось из цветного RGB формата в чёрно-белое с 256 степенями яркости. Затем, с целью избавления от шума, производилось гауссово сглаживание с размером окна 5x5 пикселей. 

2 этап —инверсная бинаризация изображения. При этом, всем пикселям с яркостью выше пороговой –  Bпорогприсваивалось значение B= 0, а в противном случае – значение B= 255. В результате было получено чёрно-белое изображение.

3 этап- устранение черных микрообъектов с помощью морфологического закрывающего (closing) фильтра с маской круглой формы размером 5x5 пикселей. 

4 этап -проводилось распознание контуров белых объектов с помощью алгоритма описанного в работе [4]. Однако, вместе с ними оказались распознаны контуры других элементов изображения – которые так же необходимо было устранить. 

5 этап - отфильтровывались контуры на основе следующих параметров: площадь, степень округлости и средняя внутриконтурная яркость.

6 этап -исключались контуры, находящиеся друг от друга на расстоянии меньшем, чем минимально возможное межклеточное расстояние – d. Параметрdбыл определён путём ручного перебора межъядерных расстояний. 

7 этап -  группировались контуры с расстоянием не больше 120 пикселей, в результате чего были точно определены контуры соответствующие именно ядрам клеток. 

8 этап -после определения всех клеточных ядер находилась площадь фигуры, в которую они входили.

Заключение:Разработанная программа может использоваться для оценки площади костных балок и для оценки интенсивности остеогенеза. Однако данная программа требует дальнейших усовершенствований и доработок, которые позволят получать наиболее точные значение площади. 

Литература

Литература 

1) Новочадов В.В. Проблема управления клеточным заселением и ремоделированием тканеинженерных матриц для восстановления суставного хряща. Вестник Волгоград. гос. ун-та. 2013; 1(5): 19-28.

2) Chesnutt B. M., Viano A. M., Yuan Y., Yang Y., Guda T., Ap- pleford M. R., Ong J. L., Haggard W. O., Bumgardner J. D. 2009a. Design and characterization of a novel chitosan/nanocrystalline calcium phosphate composite scaffold for bone regeneration. J. Bi- omed. Mater. Res. 88 : 491—502.

3) Saveleva M.S, Ivanov AN, Kurtukova MO, et al. Hybrid PCL/CaCOscaffolds with capabilities of carrying biologically active molecules: synthesis, loading and in vivo applications. Materials Science & Engineering C-Materials for biological applications 2018; 85: 57–67.

4) Satoshi Suzuki and others. Topological structural analysis of digitized binary images by border following. Computer Vision, Graphics, and Image Processing, 30(1):32 46, 1985.

0
Ваша оценка: Нет



Оптимальный хостинг для Drupal, Wordpress, Joomla, Битрикс и других CMS, быстрые и надежные сервера, круглосуточная техподдержка Яндекс.Метрика