Skip to Content

Методика автоматизированного расчёта площади хрящевой ткани на микрофотографиях области имплантации в бедренную кость крыс скаффолдов

ID: 2018-11-25-A-18740
Оригинальная статья (свободная структура)
ФГБОУВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России

Резюме

В данной работе проводилась имплантация матрицы из поликапролактона, минерализованной ватеритом с целью стимуляции регенерации костной ткани. Для оценки интенсивности восстановления ткани, а именно образования костных балок был разработан алгоритм автоматизированного анализа микрофотографий. Данный алгоритм был реализован средствами библиотеки искусственного зрения OpenCV в виде программы расчёта площади хрящевой ткани в области имплантации скаффолда.

Ключевые слова

скаффолды, крысы, регенерация, костная ткань, цифровая микроскопия.

Статья

Введение: В современное время одной из наиболее актуальных проблем медицины является стимуляция регенерации различных тканей при повреждении с помощью применения инновационных технологий тканевой инженерии, связанных с имплантацией специальных матриц или скаффолдов в очаг повреждения [1].

Данные пронизанные порами имплантаты при внедрении в область дефекта играют роль внеклеточных каркасов, в толще и по периферии которых происходит регенерация ткани. Для возможности данного процесса скаффолды должны обладать биосовместимостью, то есть они должны быть способны к клеточному заселению и васкуляризации. Так же, для оптимального использования, сроки биодеградации матриц должны быть сопоставимы со сроками восстановления участка ткани, а продукты их биологического разложения не должны оказывать токсического воздействия на организм.

При создании скаффолдов возможно использование различных материалов, имеющих как природное, так и искусственное происхождения, однако большее предпочтение отдаётся синтетическим веществам ,например, поликапролактону. Матрицы из данных веществ соответствуют необходимым требованиям, а так же клетки на данных имплантатах обладают высокой пролиферацией и адгезией [2]. Для повышения остеокондуктивных и остеоиндуктивных характеристик матриц, что очень важно при стимуляции регенерации именно костной ткани, скаффолды модифицируют различными минеральными веществами, например, ватеритом, который способен участвовать в адресной доставке предварительно адсорбированных веществ при переходе в кальцит [3].

Применение данных скаффолдов для восстановления костной ткани является инновационным направлением в тканевой инженерии и имеет перспективы клинической апробации у пациентов травматологического и ортопедического профиля. Однако для внедрения данной методики в практическую медицину необходимо проведение тщательных доклинических исследований, в частности имплантационных тестов. Критерием данных исследований является интенсивность образования костных балок, что может оцениваться с помощью расчёта их площадей на микрофотографиях.

В этой связи целью настоящей работы являлась оценка процесса регенерации костной ткани при имплантации в область дефекта бедренной кости у белых крыс скаффолдов из поликапролактона, минерализованных ватеритом с помощью подсчета площади костных балок.

Материалы и методы: Эксперимент проводился на 10 белых крысах-самцах массой 200-260 грамм. Данным животным производилась имплантация скаффолдов из поликапролактона, минерализованных ватеритом. После введения препаратов для анестезирования крысам, острым и тупым способом выполнялся доступ к бедренной кости. Производился продольный пропил длиной 5-7 мм, шириной 1-2 мм и глубиной до костномозговой полости. В данный дефект имплантировалась матриц на основе поликапролактона, минерализованных ватеритом. Рана послойно ушивалась. На 28 сутки эксперимента производился вывод животных путём передозировки препаратов для наркоза и забор материала.

Для морфологического исследования приготавливались срезы диафиза бедренной кости в области имплантации толщиной 5-7 мкм, окрашивались гематоксилином. Анализ препаратов проводили с помощью микровизора проходящего света mVizo-103.

Результаты: Для разработки алгоритма подсчёта площади хрящевой ткани использовалась микрофотография (с x20 объектива) среза диафиза бедренной кости в области имплантации скаффолда из поликапролактона, минерализованного ватеритом. При создании программы, использующей библиотеку искусственного зрения OpenCV, учитывалось несколько факторов: определение ядер клеток хрящевой ткани, данные о максимальном и минимальном расстоянии между этими ядрами и ограничение минимально возможного числа соседствующих клеток.

Для начала изображение преобразовывалось из цветного формата в чёрно-белое, проводилось гауссово сглаживание. В результате ядра клеток имели тёмный цвет, а белый – межклеточное и внутриклеточное вещество, окружающее ядра. Затем проводилась инверсная бинаризация (Bпорог=150) полученного изображения. 

Из-за того, что анализу подвергались именно белые объекты (ядра клеток хрящевой ткани), необходимо было избавиться от чёрных артефактов размером в несколько пикселей с помощью использования морфологического закрывающего фильтра с маской круглой формы (5х5 пикселей). 

Затем находились контуры ядер клеток хрящевой ткани с помощью алгоритма описанного в работе [4]. Однако, вместе с этими контурами, распознанными оказались и контуры клеточных мембран, сплющенные и сложной формы, а так же белые артефакты. Фильтрация их проводилась согласно следующим признакам: площадь контура клеточного ядра (20-1500 пикселей), степень округлости контура M≤ 60 (, где P– длина контура, а S– его площадь), средняя яркость внутри данных контуров (не больше 140). Так же проводилась фильтрация контуров, которые находились на расстоянии меньшем, чем минимально возможное межклеточное  расстояние d < 20 пикселей. Производилась группировка оставшихся контуров по данным условиям: расстояние между ядрами клеток хрящевой ткани в группе не должно превышать 120 пикселей, а минимальное число контуров в группе должно быть больше, либо равняться 7.

После проведения фильтрации всех контуров и белых артефактов находилась площадь фигуры по следующим действиям:

1)    На чёрном холсте программно были изображены белые линии между центрами ядер соседних клеток хрящевой ткани.

2)      При помощи использования процедуры распознавания контуров [4] находились все контуры, где максимальный из них охватывал все распознанные клеточные ядра.

В большинстве случаев площади хрящевой ткани, найденные программно, были меньше, чем площади найденные вручную.

Заключение: Разработанный алгоритм может использоваться для оценки интенсивности образования костных балок, однако требует дальнейших улучшений, например, возможность распознавания клеточных мембран. 

Литература

1) Новочадов В.В. Проблема управления клеточным заселением и ремоделированием тканеинженерных матриц для восстановления суставного хряща. Вестник Волгоград.гос. ун-та. 2013; 1(5): 19-28.

2) Mkhabela V, Ray SS. Biodegradation and bioresorption of poly (e-caprolactone) nanocomposite scaffolds. International Journal of Biological Macromolecules 2015;79: 186–192.

3) Saveleva M.S, Ivanov AN, Kurtukova MO, et al. Hybrid PCL/CaCO3scaffolds with capabilities of carrying biologically active molecules: synthesis, loading and in vivo applications. MaterialsScience&Engineering C-Materialsforbiologicalapplications 2018; 85: 57–67.

4) Satoshi Suzuki and others. Topological structural analysis of digitized binary images by border following. Computer Vision, Graphics, and Image Processing, 30(1):32 46, 1985.

0
Ваша оценка: Нет



Оптимальный хостинг для Drupal, Wordpress, Joomla, Битрикс и других CMS, быстрые и надежные сервера, круглосуточная техподдержка Яндекс.Метрика