Skip to Content

Механизмы дистантного стимулирующего влияния аутотрансплантации кожного лоскута на микроциркуляторное русло в условиях системных нарушений, вызванных моделью экспериментального сахарного диабета

ID: 2021-09-7-A-19639
Оригинальная статья
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Резюме

             Методы и материалы: исследования были выполнены на 32 белых нелинейных крысах. В процессе эксперимента было сформировано 3 группы животных:1-я группа – контрольная, которая включала в себя 10 интактных крыс;2-я группа–сравнительная – из 10 крыс с системными нарушениями микроциркуляции, вызванными аллоксановым сахарным диабетом;3-я группа – опытная – из 10 крыс, которым на 21-е сутки после введения аллоксана выполняли АТПКЛ.Системные нарушения микроциркуляции моделировали путем развития у животных сахарного диабета, вызванного аллоксаном. АТПКЛ у животных опытной группы осуществляли на 21-е сутки от начала эксперимента (введения аллоксана). Микрокровоток кожи тыльной поверхности стопы исследовали с помощью «ЛАКК-ОП» на 42-е сутки эксперимента у животных сравнительной и опытной групп. Результаты: при исследовании микроциркуляции кожи тыльной поверхности стопы у группы животных, с экспериментальным диабетом к 42-м суткам после введения аллоксана наблюдалось статистически значимое снижение перфузии кожи тыльной поверхности стопы по сравнению с животными в контрольной группе. У животных, которым на фоне аллоксанового диабета выполнялась АТПКЛ, на 42-е сутки эксперимента наблюдалось статистически значимое увеличение данного показателя относительно группы животных с нарушенным углеводным обменом на 43%, что свидетельствовало об улучшении состояния микроциркуляции. АТПКЛ у крыс с аллоксановым диабетом почти в два раза снижает уровень катехоламинов в крови относительно соответствующей группы сравнения. Следовательно, АТПКЛ лимитирует активность симпатической нервной системы более выражено при системных микроциркуляторных нарушениях, возникающих на фоне нарушенного углеводного обмена. Заключение: в ходе исследования отмечена положительная динамика микроциркуляторного русла в условиях системных нарушений, вызванных экспериментальным сахарным диабетом, дистантным воздействием стимулирующего влияния АТПКЛ. Положительная динамика обусловлена следующими механизмами: 1. Снижением активности симпатоадреналовой системы посредством динамики содержания катехоламинов в крови. 2. Поддержанием адекватной перфузии в дистальной конечности у крыс опытной группы. 3. Обнаруженными дегенеративными изменениями кожного лоскута, которые могут сопровождаться образованием пептидных фрагментов, выполняющих функцию цитомединов. 

Ключевые слова

Сахарный диабет, микроциркуляция, аутотрансплантация

Введение

Физиологической основой поддержания гомеостаза в тканях и органах живых организмов является транскапиллярный обмен в микроциркуляторном русле, при этом нормальное функционирование микроциркуляции связано с метаболической активностью клеток. [3] Сахарный диабет (СД) — эндокринное заболевание, которое приняло характер самой распространенной неинфекционной эпидемии. При сахарном диабете наблюдаются системные нарушения микрокровотока, которые являются основным звеном в патогенезе патологических процессов, а также играют важную роль в процессе саногенеза, обеспечивая трофическую поддержку репаративных процессов. В условиях нормы и патологии собственные клетки и ткани организма способны влиять на состояние микроциркуляции за счет синтеза и выделения биологически активных веществ, регулирующих микроциркуляцию на системном уровне. Особое значение микроциркуляторные реакции имеют при регенерации различных тканей. Современный уровень развития научных знаний определяет процесс регенерации тканей организма как сложный комплекс взаимосвязанных последовательных местных и общих реакций. [4] В регенеративной медицине тканей использовались препараты на основе плаценты, которые ускоряли процессы регенерации, но несмотря на эффективность применения аллотканей, включая ткани фетоплацентарного комплекса, в клинике их использование связано с риском развития аллергических реакций и иммунных осложнений. Поэтому более перспективным методом стимуляции регенераторных процессов является использование аутотканей, в частности кожи.

Актуальность исследования: системные нарушения микрокровотока являются основным звеном в патогенезе патологических процессов таких, как  диабетическая ангиопатия в результате повреждения сосудов и нарушение почечного кровотока в результате почечной вазоконстрикции. 

Задача настоящего исследования: выявить механизмы стимулирующего влияния АТПКЛ на микроциркуляторное русло в условиях системных нарушений, вызванных экспериментальным сахарным диабетом.

Цель

Цель настоящего исследования: изучение особенностей механизмов реализации дистантного стимулирующего действия аутотрансплантации полнослойного кожного лоскута (АТПКЛ) на перфузию микроциркуляторного русла при системных микроциркуляторных нарушениях.

Материал и методы

Исследования были выполнены на 32 белых нелинейных крысах. Эксперимент проводился в соответствии с рекомендациями этического комитета Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского
В процессе эксперимента было сформировано 3 группы животных:
1-я группа – контрольная, которая включала в себя 10 интактных крыс;
2-я группа–сравнительная – из 10 крыс с системными нарушениями микроциркуляции, вызванными аллоксановым сахарным диабетом;
3-я группа – опытная – из 10 крыс, которым на 21-е сутки после введения аллоксана выполняли АТПКЛ.
Системные нарушения микроциркуляции моделировали путем развития у животных сахарного диабета, вызванного аллоксаном, который оказывает прямое β-цитотоксическое действие на островковый аппарат поджелудочной железы и вызывает абсолютную недостаточность инсулина, характерную для сахарного диабета 1-го типа [2]. Аллоксан в дозе 100 мг/кг веса животного вводили подкожно однократно. Развитие сахарного диабета верифицировано статистически достоверным (р < 0,05) повышением уровня гликированного гемоглобина в 1,7 раза по сравнению с интакными животными до 9,3 (6,9; 12,1) %.
АТПКЛ у животных опытной группы осуществляли на 21-е сутки от начала эксперимента (введения аллоксана). Полнослойный кожный лоскут размером 0,1% от площади поверхности тела животного иссекался в межлопаточной области, обрабатывали поочередно в перекиси водорода 3%, этиловом спирте 70% и физиологическом растворе 0,9%. В ране, образовавшейся при иссечении лоскута, формировали подкожный карман, в который помещали обработанный аутотрансплантат. Операционная рана ушивалась наглухо [1].
Микрокровоток кожи тыльной поверхности стопы исследовали с помощью «ЛАКК-ОП» на 42-е сутки эксперимента у животных сравнительной и опытной групп. В качестве контроля были использованы ЛДФ-граммы интактных животных. Состояние микроциркуляции оценивали по величине показателя перфузии в перфузионных единицах. Забор крови у животных осуществляли на 42-е сутки эксперимента пункцией правых отделов сердца с использованием пробирок с активатором свертывания и разделительным полиэфирным гелем для получения сыворотки, а также с 3,2% цитратом натрия для получения плазмы и изготовления мазков. Уровень катехоламинов (КА) в крови в качестве основных вазоконстрикторных веществ определяли микроскопией с помощью микровизора мазков, окрашенных цитохимическим методом по А.И. Мардарь и Д.П. Кладиенко (1986) нитратом серебра и эозином с предварительной экспозицией в растворе бихромата калия для получения адренохромов сорбированных на эритроцитах. Уровень КА в крови выражали в условных единицах, определяемых как количество адсорбированных на 100 эритроцитах мазка гранул импрегнированных серебром адренохромов
Животные выводились из эксперимента передозировкой препаратов для наркоза непосредственно после забора крови. Ткани зоны АТПКЛ забирались и фиксировались в 10% формалине для гистологического исследования. В качестве контроля использовали образцы кожи интактных животных. Гистологические срезы толщиной 5 мкм окрашивались гематоксилином Майера) и эозином . Микроскопию препаратов зоны АТПКЛ выполняли с помощью системы AxioImager Z2. Количественный подсчет клеточных популяций дермы аутотрансплантата выполнялся при увеличении объектива ×40.
Статистическую обработку выполняли средствами пакета программ Statistica 10.0. Большинство полученных данных не соответствовали закону нормального распределения, поэтому представлены в виде медианы и интерквартильного размаха. Сравнение между группами проводилось с расчетом U критерия Манна–Уитни и показателя достоверности различия р, критический уровень которого принимали равным 0,05.
 

Результаты

При исследовании микроциркуляции кожи тыльной поверхности стопы у группы животных, с экспериментальным диабетом к 42-м суткам после введения аллоксана наблюдалось статистически значимое снижение перфузии кожи тыльной поверхности стопы по сравнению с животными в контрольной группе, что свидетельствует о редукции микрокровотока.
У животных, которым на фоне аллоксанового диабета выполнялась АТПКЛ, на 42-е сутки эксперимента наблюдалось статистически значимое увеличение данного показателя относительно группы животных с нарушенным углеводным обменом на 43%, что свидетельствовало об улучшении состояния микроциркуляции. При сравнении группы сравнения и опытной группы установлено, что уровень перфузии статистически выше у животных, которым выполнялась АТПКЛ на фоне системных нарушений микрокровотока (рис.).
Так же у животных с системными нарушениями микроциркуляции, индуцированными аллоксановым диабетом, к 42-м суткам также наблюдается значительное повышение содержания катехоламинов в крови. АТПКЛ у крыс с аллоксановым диабетом почти в два раза снижает уровень катехоламинов в крови относительно соответствующей группы сравнения. Следовательно, АТПКЛ лимитирует активность симпатической нервной системы более выраженно при системных микроциркуляторных нарушениях, возникающих на фоне нарушенного углеводного обмена (табл. 1)

Установлено, что АТПКЛ, выполненная на фоне нарушенного углеводного обмена, увеличивает концентрацию гистамина в плазме на 42-е сутки эксперимента, которая превышает как контрольные значения, так и значения группы сравнения в среднем в 2,5 раза (табл. 1).

При микроскопии препаратов тканей области аутотрансплантации обнаружено истончение кожного лоскута, которое сопровождается вырождением эпидермиса. Вместе с тем отмечается изменение состава клеточных популяций дермы аутотрансплантата, проявляющееся в увеличении числа фибробластов, лимфоцитов и макрофагов. Отличительная особенность препаратов данной группы - увеличенное количество эозинофилов(табл. 2).

В ходе морфологического анализа препаратов у животных с аллоксановым диабетом было обнаружено, что к 42-м суткам эксперимента наблюдалось истончение аутотрансплантата. У 20% крыс данной группы в нем отсутствовал эпидермис. Толщина гиподермы резко уменьшалась у всех животных. В дерме и гиподерме наблюдались полнокровные артериальные и венозные сосуды. В составе дермы присутствовали дегенерирующие волосяные фолликулы. Дерма аутотрансплантата содержала большое количество фибробластов, была умеренно инфильтрирована лейкоцитами. В составе лейкоцитарной инфильтрации доминировали лимфоциты и клетки макрофагального ряда.  У животных на фоне нарушенного углеводного обмена присутствовали единичные эозинофилы в дерме аутотрансплантата.

Обсуждение

В ходе настоящего исследования было установлено, что ключевым патогенетическим звеном , вызывающим нарушение микрокровотока у крыс с алаксановым сахарным диабетом является повышение тонуса гладкомышечных клеток сосудов прекапиллярного звена и вазококонстрикции мелких артерий и артериол, что проявляется уменьшением перфузии кожи тыльной поверхности стопы. Это может быть связано с тем , что у этих животных норадреналин (КА) вызывает редукцию артериального и венозного кровотока кожи спины без последующего восстановления, что отражает стойкую вазоспастическую реакцию, обусловленную гиперчувствительностью сосудов к катехоламинам [8]. Полученные в ходе настоящего исследования результаты свидетельствуют, что у крыс при аллоксановом диабете повышается уровень циркулирующих катехоламинов. Повышение содержания катехоламинов в крови при аллоксановом диабете может быть связано с влиянием гипергликемии на активность ферментов, обеспечивающих синтез и разрушение этих биогенных аминов. Так, в условиях эксперимента было показано, что гипергликемия у крыс с диабетом повышает в мезангиальных клетках почек экспрессию тирозингидроксилазы, сопровождающуюся повышенным потреблением тетрагидробиоптерина и увеличением продукции катехоламинов. Следовательно, развивающиеся при диабете микроциркуляторные нарушения обусловлены, повышением уровня циркулирующих катехоламинов[5]. АТПКЛ в межлопаточной области при аллоксановом диабете оказывает дистантное стимулирующее действие на микроциркуляцию кожи тыльной поверхности стопы у белых крыс. Перфузионный показатель кожи поверхности стопы у экспериментальных животных опытной группы увеличивался в среднем на 43–44% относительно соответствующей группы сравнения.
Авторами в работе [6] было показано, что аллоксан у крыс значительно снижает содержание тучных клеток в коже. Учитывая менее выраженное увеличение уровня гистамина в плазме при АТПКЛ в условиях нарушений углеводного обмена, можно предположить, что малое число эозинофилов в составе аутотрансплантата у крыс с аллоксановым диабетом обусловлено снижением интенсивности дегрануляции тучных клеток.

Заключение

В ходе исследования отмечена положительная динамика микроциркуляторного русла в условиях системных нарушений, вызванных экспериментальным сахарным диабетом, дистантным  воздействием стимулирующего влияния АТПКЛ.

Положительная динамика обусловлена следующими механизмами:

  1. Снижением активности симпатоадреналовой системы посредством динамики содержания катехоламинов в крови.
  2. Поддержанием адекватной перфузии в дистальной конечности у крыс опытной группы.
  3. Обнаруженными дегенеративными изменениями кожного лоскута, которые могут сопровождаться образованием пептидных фрагментов, выполняющих функцию цитомединов.

Литература

  1. Иванов АН, Шутров ИЕ, Норкин ИА. Аутотрансплантация полнослойного кожного лоскута как способ биостимуляции микроциркуляции в условиях нормальной и нарушенной иннервации. Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2015; 3 (55): 59–65.
  2. Джафарова РЭ. Сравнительное исследование различных моделей аллоксан-индуцированного сахарного диабета. Казанский медицинский журнал. 2013; 94 (6): 915–919.
  3. Миронов СП, Крупаткин АИ, Голубев ВГ, Панов ДЕ. Диагностика и выбор тактики лечения при повреждениях периферических нервов. Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. 2005; 2: 33– 39.
  4. Михайлусов РН. Факторы роста – перспективные технологии воздействия на раневой процесс. Харківська хірургічна школа. 2014; 5 (68): 90–98
  5. Marco GS, Colucci JA, Fernandes FB, Vio CP, Schor N, Casarini DE. Diabetes induces changes of catecholamines in primary mesangial cells. Int J Biochem Cell Biol. 2008; 40 (4): 747–754.
  6. De F Carvalho V, Campos LV, Farias-Filho FA, Florim LT, Barreto EO, Pirmez C et al. Suppression of allergic inflammatory response in the skin of alloxan-diabetic rats: relationship with reduced local mast cell numbers. Int Arch Allergy Immunol. 2008; 147 (3): 246–254.
  7. Анохова ЛИ, Патеюк АВ, Кузник БИ, Кохан СТ. Сравнительное влияние полипептидов эндометрия и тималина на некоторые показатели иммунитета и гемостаза в опытах in vitro и in vivo. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2011; 6: 156–159.
  8.  Feng W, Shi R, Zhang C, Liu S, Yu T, Zhu D. Visualization of skin microvascular dysfunction of type 1 diabetic mice using in vivo skin optical clearing method. J Biomed Opt. 2018; 24 (3): 1–9.

Таблицы

Рис. Изменение перфузионного показателя кожи тыльной поверхности стопы при АТПКЛ на фоне аллоксанового диабета.        Таблица 1

Изменение содержания вазоактивных веществ в крови после АТПКЛ у животных с аллоксановым диабетом

Группа

Показатель

Контроль

Группа сравнения

(диабет)

Опытная группа

(диабет+АТПКЛ)

Концентрация КА в крови, у.е.

22 (16;25)

56 (49; 60)

p1= 0,000001

30 (26; 33)

p1= 0,001236

p2= 0,000001

p1=  0,000003

Гистамин, мг/л

1,7 (0,6; 2,1)

1,1 (0,6; 2,2)

p1= 0,732678

2,8 (2,2; 3,2)

p1= 0,025348

p2= 0,021828

p1=  0,023271

     

Таблица 2

Динамика клеточных популяций дермы аутотрансплантата у животных с   аллоксановым диабетом

           Группа

Показатель 

Контроль

Опытная группа

(аллоксановый диабет + АТПКЛ)

Фибробласты

42 (27; 52)

119 (97; 165)

р1= 0,000028

р2= 0,0394742

Фиброциты

18 (13; 23)

27 (21; 44)

p1 = 0,034962

p2 = 0,183147

Нейтрофилы

0 (0; 0)

0 (0; 1)

p1 = 0,291698

p2 = 0,044686

Эозинофилы

0 (0; 0)

1 (0; 2)

p1 = 0,010519

p2 = 0,000292

Лимфоциты

0 (0; 2)

20 (14; 27)

p1 = 0,000017

p2 = 0,077135

Моноциты / гистиоциты / макрофаги

0 (0; 0)

2 (0; 3)

p1 = 0,047679

p2 = 0,394742

Примечание. p1 – значимость различий относительно контроля; p2 – значимость различий относительно группы сравнения.

0
Ваша оценка: Нет



Яндекс.Метрика