Введение. Распространенность резистентности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам в настоящее время является ключевой проблемой мирового здравоохранения. Нерациональное и частое использование антибиотиков приводит к множественной лекарственной устойчивости микроорганизмов. В центре внимания находятся не только патогенные штаммы, но и условно-патогенные, являющиеся основным «банком» генов антибиотикорезистентности. Серьезность сложившейся ситуации побудила Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ) составить перечень антибиотикорезистентных  возбудителей, распространение которых вызывает наибольшую угрозу [1]. В этиологической структуре инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, ведущая роль принадлежит грамположительным условно-патогенным бактериям, в частности стафилококкам. Стафилококки являются возбудителями различных угрожающих жизни инфекций из-за высокой вирулентности и способности адаптироваться к изменяющимся условиям среды, в частности, к антимикробным препаратам. Распространение метициллинрезистентных госпитальных (HA-MRSA) и высоковирулентных внебольничных (CA-MRSA) штаммов стафилококков обусловлено их устойчивостью к химиотерапевтическим препаратам [2]. Современные исследования выявили множественные механизмы устойчивости штаммов Staphylococcus aureus(S. aureus) к различным группам антибиотиков. Таким образом, своевременное понимание и изучение лекарственной устойчивости стафилококков на молекулярно-генетическом уровне позволит обеспечивать эффективные меры профилактики и лечения госпитальных инфекций, вызванных золотистым стафилококком, а также следить за эволюционными изменениями микроорганизма.

Целью данного исследования является изучение особенностей устойчивости к антимикробным препаратам штаммов S. aureus.

Материал и методы. В исследование было взято 178 штаммов S. aureus, выделенных в ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского МЗ РФ. Университетская клиническая больница №1 им. С.Р. Миротворцева в 2020 году.

Для проведения анализа резистентности S. aureus к антимикробным препаратам нами были выбраны следующие гены: mecA – ген кодирующий резистентность  бета-лактамам и цефалоспоринам,  ermA – ген, кодирующий резистентность к макролидам и линкозамидам, tetM – ген, кодирующий резистентность к тетрациклинам, gyrА и parC – гены резистентности к фоторхинолонам [3,4].

Нуклеотидные последовательности указанных генов были получены из NCBI GenBank. Для сравнения полученных нуклеотидных последовательностей генов использовался алгоритм поиска blast-n.

Результаты и обсуждение. В исследование были взяты следующие штаммы  S. aureus, выделенные в ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского МЗ РФ. Университетская клиническая больница №1 им. С.Р. Миротворцева в 2020 году: экстренное хирургическое отделение (раны) - 5 штаммов, отделение анестезиологии и реанимации №1 (интубационная трубка)  - 1 штамм, копрологическое отделение (раны) – 5 штаммов,  детское хирургическое отделение – 157 штаммов  (раны -147, выпот - 4, грудное молоко – 3, зев -2, глаза -1), детское урологическое отделение (моча) – 2 штамма, взрослое урологическое отделение (моча) – 8 штаммов.

С целью определения чувствительности штаммов к антибиотикам в работе использовались диски, пропитанные следующими химиотерапевтическими препаратами:

1) цефалоспорины: цефазолин, цефотикситин, цефтазидим, сульзонцеф, цефтриаксон, цефотаксим, цефоперазон, цефепим;

2) линкозамиды: линкомицин, клиндамицин;

3) макролиды: кларитромицин;

4) тетрациклины: доксициклин;

5) фторхинолоны: ципрофлоксацин, левофлоксацин, норфлоксацин;

6) аминогликозиды: амикацин, гентамицин;

7) бета-лактамы: амоксиклав, азтреонам, ампициллин;

8) карбапенемы: меропенем, имипенем;

9) производные нитрофурана: фурадонин;

10) сульфаниламиды: котримоксазол.

Определение чувствительности к антибиотикам проводили в соответствии с МУК М УК 4.2.1980-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Способ определения основан на способности антибиотиков диффундировать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганизмов, посеянных на поверхности агара Мюллера-Хинтон (табл.1).  

Таким образом, изученные клинические штаммы были резистентны к нескольким группам химиотерапевтических препаратов: цефалоспоринам (цефазолин, цефотиксим), линкозамидам (линкомицин) и макролидам (кларитромицин), тетрациклинам (доксициклин), фторхинолонам (ципрофлоксацин).

С целью дальнейшего понимания механизмов резистентности клинических штаммов к химиотерапевтическим препаратам, выявленной диско-диффузионным методом, на следующем этапе работы при анализе литературных данных были установлены гены, отвечающие за резистентность микроорганизмов к указанных группам химиотерапевтических препаратов. Резистентность к цефалоспоринам обусловлена геном mecA, макролидам и линкозамидам генами ermA,B,C и mef, тетрациклинам – геном tet(M), tet(K), фоторхинолонам – гены gyrА и gyrB, parC и parE, плазмида QnrB [3,4].

Для дальнейшего изучения генетических особенностей штаммов золотистого стафилококка был проведен молекулярно-генетический генов антибиотикорезистентности штаммов S. aureus, представленных в международной базе данных GenBank c использованием алгоритма blast-n.

В исследование были взяты нуклеотидные последовательности гена mecA, (определяющим резистентность к метициллину, бета-лактамам и цефалоспоринам) штаммов N315, Mu50 представленных в GenBank [5]. Штамм N315 был выделен в 1982 году из мокроты японского пациента. Этот штамм является прототипом  MRSA (пре-MRSA), поскольку имел ген mecA, но был чувствителен к метициллину. Штамм Mu50  – клиническиq изолят, выделенный в 1997 году. Данный штамм имел устойчивость не только к бета-лактамам, но и умеренную устойчивость к ванкомину [5].

При дальнейшем исследовании с помощью алгоритма blast-n нами установлено, что идентичность гена mecA штаммов N315 и Mu50  является 100%. Идентичность mecA штаммов N315 и Mu50  с геном mecA других штаммов S. aureus и S. epidermidis, а также S. pseudintermedis составляла 99,95%. Штамм N315 имел ген mecA, идентичный данному гену  других штаммов S. aureus, резистентных  к метициллину, однако экспрессия этого гена у штамма N315 не была выражена фенотипически. Это позволяет сделать вывод, что наличие гена не всегда свидетельствует о возможном проявлении признака, а экспрессия генов обусловлена множественными факторами.

В 2000-х годах (Лондон) в отделении интенсивной терапии одной из клиник в течение нескольких лет в регистрировались случаи выделения высокотрансмиссивного метициллин-устойчивого штамма Staphylococcus aureus (MRSA) (обозначенного TW). Данный штамм был устойчив к пенициллину, метициллину, эритромицину, ципрофлоксацину, гентамицину, неомицину, триметоприму и тетрациклину, а также хлоргесидину [6]. В международной базе данных представлена полногеномная последовательность штамма Staphylococcus aureus subsp. aureus TW20 (GenBank: FN433596.1).

При сравнении идентичности гена mecA штамма золотистого стафилококка TW20 со штаммами N315, Mu50 выявлено, что они идентичны на 99,8%. Кроме того, при анализе нуклеотидной последовательности гена mecA штамма TW20 было установлено, что идентичная последовательность данного гена была у 17 штаммов золотистого стафилококка, представленных в GenBank и выделенных из различных источников. На 99,9% данная последовательность изучаемого гена встречалась у некоторых штаммов Staphylococcus hominis, Staphylococcus pseudintermedius, Mammaliicoccus sciuri, Staphylococcus epidermidis – условно-патогенных микроорганизмов, которые могут являться донорами разнообразных генов антибиотикорезистентности.

 На следующем этапе работы в штамме золотистого стафилококка TW20 также были определены гены устойчивости к химиотерапевтическим препаратам: erm A, tetM, гены gyrА, parC.

Установлено, что в  геноме штамма стафилококка TW20 также присутствовал ген ermA, ответственный за резистентность к макролидам и линкозамидам. При анализе было определено, что последовательность данного гена была на 100% идентична множеству штаммов золотистого стафилококка, в том числе N315, Mu50, а также штаммам Enterococcusfaecium, Staphylococcusepidermidis, Staphylococcuspseudintermedius.

Ген tetM штамма TW20 был абсолютно идентичен множеству штаммов S.aureus, в частности Mu50, тогда как у штамма N315 не обнаружен. Кроме того, ген tetM был обнаружен у  Jeotgalibaca porci, Streptococcusagalactiae, Enterococcusavium, Enterococcusfaecalis, Streptococcuspyogenes, Listeriamonocytogenes, Staphylococcus pseudintermedius. Таким образом, ген tetM распространен среди множества условно-патогенных микроорганизмов (рис.1).

Рисунок 1. Филогенетическое дерево, построенное с помощью Blast Tree View (BLAST pairwise alignments) на основе гена tetM штамма S. aureus TW20 (GenBank: FN433596.1)

У штамма TW20 также были обнаружены гены gyrА, parC играющие роль в устойчивости к фторхинолонам. Стоит отметить, что у штаммов N315, Mu50 также присутствовали данные гены. Идентичность гена gyrА у всех трех штаммов была 100%, тогда как идентичность гена parC у штаммов N315, Mu50 по сравнению с TW20 составляла 99,63% и 99,67% соответственно.  Таким образом, проведенные нами исследования подтверждают множественную лекарственную устойчивость клинических штаммов S. aureus, которая обусловлена присутствием в их геноме генов антибиотикорезистентности. Данная проблема уходит своими корнями в сложные экологические и эволюционные отношения между самими микроорганизмами. Интерпретация механизмов широкого распространения в клинике антибиотикорезистентных штаммов бактерий как явления, вызванного исключительно применением антибиотиков, сильно упрощает понимание данной проблемы и обозначает возможные пути их решения [7].

Выводы.

1. Лекарственная устойчивость штаммов S. aureus обусловлена присутствием в их геноме множества генов устойчивости к антимикробным препаратам.

2. Штаммы условно-патогенных микроорганизмов содержат в своем геноме большое количество генов резистентности к химиотерапевтическим препаратам, играя основополагающую роль в горизонтальном переносе данных генов и развитии внутрибольничных инфекций.