Оптимизация условий прямой и обратной реакций агглютинации эритроцитов, усиленных стоячей ультразвуковой волной

ID: 2013-03-3930-A-2642

Оригинальная статья

Дубровский В.А., Медведева М.Ф.

ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава РФ, Кафедра медбиофизики им. проф. В.Д. Зернова

Резюме

Ключевые слова

агглютинация эритроцитов ультразвук

Введение

Автоматизация определения группы крови человека по системе ABO и Rh (системе резус) является актуальной задачей в связи большой частотностью этого вида лабораторного теста. Фирмами выпускаются различные модификации приборов такого рода, например (таблица 1):

В то же время существует немало теоретических и экспериментальных работ, направленных на усовершенствование имеющихся и разработку новых принципов конструирования подобных устройств, например, [1-9]. Одной из основных проблем, решаемых авторами, является повышение «разрешающей способности» (разрешение) разрабатываемого метода определения группы крови. Напомним, что под разрешающей способностью обычно понимают отношение измеряемого сигнала B+, соответствующего положительной реакции агглютинации (эритроцитарные агглютинаты образуются), к уровню сигнала B- для отрицательной реакции агглютинации (формирование агглютинатов отсутствует). Очевидно, что увеличение разрешающей способности K = B+/B- повышает надежность определения группы крови. Чрезвычайно важно отметить, что ошибка в определении группы крови образца должна исключаться абсолютно, единственное послабление прибору – в некоторых случаях он может не определить группу крови анализируемой пробы.

С целью повышения разрешения оптических методов регистрации реакции агглютинации эритроцитов в [10] было предложено использовать действие стоячей ультразвуковой (УЗ) волны на смесь «кровь-сыворотка». При облучении ультразвуком раствора смеси «кровь-сыворотка» в кювете образуется стоячая УЗ волна, которая приводила к группировке эритроцитов и их комплексов в области узлов. В результате раствор клеток крови расслаивался с пространственным периодом, равным половине ультразвуковой длины волны (λ/2). Сближение эритроцитов в узловых областях приводит к увеличению вероятности их взаимодействия, а следовательно, агглютинации при положительной реакции. При этом возрастают как скорость реакции агглютинации, так и размеры иммунных эритроцитарных комплексов и, как результат, скорость седиментации агглютинатов при выключении УЗ генератора (окончание эффекта левитации эритроцитов и агглютинатов). Оптически исследуемая среда становимтся более прозрачной.

При отрицательной реакции агглютинации эритроциты также группируются в узловых областях, формируются «неспецифические» аггрегаты, которые рассыпаются на отдельные эритроциты при выключении ультразвука. Естественно, скорость оседания «свободных» эритроцитов значительно ниже, чем агглютинатов, среда длительное время остается мутной. Различие в величине коэффициента пропускания исследуемых образцов для положительной и отрицательной реакций соответственно несет информацию о том, состоялась реакция агглютинации или нет, что используется для определения группы крови образца. По-видимому можно говорить о создании нового, акусто-оптического метода регистрации аглютинации эритроцитов, а, следовательно, определения группы крови. Этот метод основан на сочетании действия ультразвука на реакционную смесь «кровь-сыворотка» с оптическим ее зондированием. Детально механизм взаимодействия смеси «кровь-сыворотка» с ультразвуком рассмотрен в [11,12]. Регистрация укрупненных с помощью ультразвука агглютинатов методом проточной цитометрии осуществлена в [13,14], а с использованием явления седиментации в [15-17].

Следует отметить, что в работах [11-17] исследовалась агглютинация эритроцитов лишь на основе прямого метода – взаимодействие эритроцитов донорской крови со стандартной сывороткой. Известно, что в реальном типировании крови для обеспечения надежности используется «перекрестный» метод (кросс-метод), т.е. прямой метод анализа дополняется обратным - взаимодействие плазмы донорской крови со стандартными эритроцитами. Можно предположить, что применение обратного метода типирования крови потребует нахождения специфических по отношению к прямому оптимальных условий, при которых разрешающая способность акусто-оптического метода определения группы крови максимальна.

Цель

Задача настоящей работы – выявление оптимальных условий для агглютинации эритроцитов с целью повышения разрешения разрабатываемого акусто-оптического метода определения группы крови перекрестным образом.

Материал и методы

1. Общие сведения о биообъекте, пробоподготовке и технике экспериментов

В качестве объекта исследования выступала донорская кровь, стандартные агглютинирующие сыворотки и стандартные эритроциты. Независимо от вида перекрестного анализа типа крови, донорская кровь подвергалась центрифугированию и разделению на фракции: плазма и эритроцитарная масса. При проведении экспериментов прямой регистрации агглютинации эритроцитов приготавливалась трехкомпонентная смеси, состоящая из исследуемых эритроцитов, стандартной сыворотки и физиологического раствора. В случае обратной реакции агглютинации смесь включала в себя плазму того же образца крови, соответствующую порцию стандартных эритроцитов и физиологический раствор. При этом в обоих случаях с целью оптимизации соотношений компонент смеси их величины экспериментально варьировались.

Сразу после приготовления смеси каждая проба подвергалась воздействию стоячей ультразвуковой волны. Кювета с исследуемой смесью располагалась на пьезопреобразователе, волна ориентировалась в вертикальном направлении. Для возбуждения пьезокерамического преобразователя использовался генератор Г3-112/1 с усилителем, а его выходное напряжение контролировалось осциллографом С1-79. Генератор настраивался резонансно по отношению к преобразователю ν=2,25 МГц, а его выходное напряжение, подаваемое на пьезокерамику, не превышало 15 В, что обеспечивало ультразвуковое действие на эритроциты без их гемолиза. Время действия ультразвука, а также время последующей инкубации образца экспериментально варьировались.

Биообъект зондировался коллимированным излучением светодиода типа LXHL-G1S, спектр которого соответствовал спектру поглощения гемоглобина в зеленой области (рис1).

Из рис. 1 видно, что спектр излучения светодиода совпадает с одним из максимумов спектра поглощения гемоглобина в зеленой области. Режим питания светодиода типа LXHL-G1S: напряжение 3В, сила тока 0,3 А

В момент выключения ультразвука включалась CCD и в течение 1,5 минут снималось видео оседания агглютинатов. Типичные фото кадры для положительной и отрицательной реакций агглютинации эритроцитов представлены на рис.2.

Луч, прошедший исследуемый раствор, поступал на полихромную веб-камеру Logitect-Quick Cam, подключённую к ПК. Полученные видео изображения соответствовали процессу седиментации эритроцитов и/или их иммунных комплексов в течение 1,5 минут. Из полученных видеофайлов выбирались изображения, которые затем раскладывались на три цветовых канала RGB. В G (зеленом) канале для каждого изображения рассчитывалась средняя яркость пиксела B (brightness) по заданной области (рис. 2). Средняя яркость B являлась мерой, которая отображала процессы, происходящие в биообъекте, при положительной или отрицательной реакций агглютинации для разных условий экспериментов.

2. Оптимизация времени ультразвукового облучения биообъекта.

Оптимизация времени УЗ действия проводилась на примере обратной реакции агглютинации (подобные исследования для прямой реакции проводились в [16]). Образцы крови III(B) группы были центрифугированы (3000 обор/мин, 8 минут), а плазма отобрана для проведения экспериментов. Во всех пробах использовалось одно и то же разведение: к одной части стандартных эритроцитов добавлялось 5 частей исследуемой плазмы и 5 частей физиологического раствора (плазма разводилась вдвое, 1:1). Объем кюветы составлял 1800 мкл, толщина зазора – 3 мм. Отрицательная и положительная реакции наблюдались всегда для одного и того же образца плазмы. Для получения положительной реакции агглютинации эритроцитов использовались стандартные эритроциты II(A) группы, а для контрольной отрицательной реакции стандартные эритроциты III(B) группы. Сразу после приготовления проба подвергалась воздействию стоячей ультразвуковой волны. Время воздействия варьировалось от 10 секунд до 3 минут. Затем в течение 1,5 минут снималось видео оседания агглютинатов. Обработка результатов проводилась согласно разделу 1.

3. Оптимизация разведения плазмы исследуемой крови (обратный метод)

Эксперименты данного типа требуют довольно большого количества плазмы крови одной группы. Поэтому центрифугированию подвергались по пять образцов крови II(A) и III(B) групп (3000 обор/мин, 8 минут). Затем в каждой пробе крови отобралось по 2 мл плазмы и образцы плазмы одной группы, но разных доноров смешивались для проведения дальнейших экспериментов. Во всех образцах смеси «плазма-стандартные эритроциты-физраствор» объемная доля стандартных эритроцитов оставалась неизменной и составляла 1/11 часть (9,09%). Таким образом, 10 частей приходилось на смесь плазмы и физиологического раствора. Разбавление плазмы физиологическим раствором варьировалось от неразбавленной плазмы до разведения 1:39, когда на 1 часть плазмы приходилось 39 частей физиологического раствора. Объем кюветы составлял 1800 мкл, толщина зазора – 3 мм. В опытах со II(A) группой крови для получения положительной реакции агглютинации эритроцитов использовались стандартные эритроциты III(B) группы, а для контрольной отрицательной реакции II(A) группы; в опытах с III(B) группой крови – наоборот.

4. Оптимизация разведения раствора стандартных эритроцитов (обратный метод)

Для нахождения оптимальной степени разведения раствора стандартных эритроцитов центрифугировались пять образцов крови III(B) группы (2000 обор/мин, 5 минут). Затем от каждого образца было отобрано по 1,9 мл плазмы для дальнейших экспериментов. Во всех пробах объемная концентрация исследуемой плазмы (C_пл) оставалась неизменной и составляла 18%. Это значение было выбрано в качестве оптимального по результатам экспериментов раздела 3. Количество стандартных эритроцитов изменялось от равного количеству исследуемой плазмы (разведение 1:1) до разведения 1:17, когда на одну часть стандартных эритроцитов приходилось 17 частей исследуемой плазмы. Объем кюветы составлял 2800 мкл, толщина зазора – 5 мм. Для получения положительной реакции агглютинации эритроцитов использовались стандартные эритроциты II(A) группы, а для контрольной отрицательной реакции III(B) группы. Время ультразвукового действия на трех компонентную смесь «плазма-стандартные эритроциты-физраствор» составляло 1 минуту для всех проб.

5. Оптимизация разведения эритроцитов (прямой метод)

Образец крови III(B) группы был центрифугирован (3000 обор/мин, 8 минут). Разведение эритроцитарной массы физиологическим раствором варьировалось от 1:25 до 1:175. Оптимальное отношение количества сыворотки к количеству эритроцитов (эритроцитарной массы) во всех пробах оставалось неизменным 10:1. Для получения положительной реакции агглютинации эритроцитов использовались стандартная сыворотка II(A) группы, а для контрольной отрицательной реакции III(B) группы.

Результаты

Нахождение оптимального времени действия ультразвука на исследуемый биообъект для обратного метода регистрации агглютинации эритроцитов осуществлялось по методике раздела 2. Экспериментальные результаты отражены на рис. 4. Из рисунка видно, что оптимальные значения времени действия лежат в интервале от 30 до 60 с. При больших временах разрешение K падает в основном за счет возрастания яркости B_-- , что объясняется следующим образом. При больших временах действия эритроциты в узлах стоячей УЗ волны образуют сравнительно прочные агрегаты (агглютинация отсутствует) и при выключении ультразвука эти агрегаты седиментируют, а среда просветляется.

Оптимизация разведения плазмы исследуемой крови (обратный метод) при постоянстве содержания стандартных эритроцитов осуществлялась по методике раздела 3. Экспериментальные результаты иллюстрируются рис. 4.

Обсуждение

Из рис. 4 легко видеть, что оптимальное значение концентрации исследуемой плазмы варьируется в диапазоне 10÷50 (%). Полученный результат можно трактовать следующим образом. При сильном разведении исследуемой плазмы (концентрация плазмы ниже 10%) содержание агглютининов не достаточно для склеивания (агглютинации) максимально возможного числа стандартных эритроцитов. В то же время при чрезмерных разведениях исследуемой плазмы (концентрация более 50%) агглютининов оказывается не достаточно для агглютинации большей части стандартных эритроцитов. Вышеуказанные пределы разведения плазмы (концентрация плазмы 10÷50(%)) являются оптимальными.

Эксперименты по нахождению оптимального разведения раствора стандартных эритроцитов при постоянстве степени разведения исследуемой плазмы (обратный метод) осуществлялся по методике раздела 4. Результаты показаны на рис.5. Степень разведения исследуемой плазмы составляла 18%, что соответствует максимуму величины K на рис. 4.

Из рис.5 видно, что оптимальными степенями разведения стандартных эритроцитов являются величины в пределах 5÷15 (%). Полагаем, что трактовка результатов рис.5 может быть подобной трактовке результатов, изображенных на рис.4.

Для прямого метода регистрации агглютинации нахождение оптимальных разведений исследуемых эритроцитов проводилось по методике раздела 5. Результаты демонстрирует рис. 6. Соотношение компонент «сыворотка-эритроциты» составляла 10:1.

Рис.6 показывает, что оптимальное разведение исследуемых эритроцитов эритроцитарной массы составляет 1÷2 (%), что близко к результатам, например [11,12,17].

Сводная таблица 2 демонстрирует оптимальные режимы акусто-оптического метода регистрации агглютинации эритроцитов перекрестным методом.

Заключение

Эксперименты позволяют сделать следующие выводы.

1) Найдены оптимальные условия для обеих компонент перекрестного метода типирования крови. При этом оптимальные условия для прямого метода анализа не всегда совпадают с подобными условиями для обратного.

2) Анализ и сопоставление прямого и обратного подходов кросс-метода типирования крови является дальнейшим этапом в разработке акусто-оптического метода определения группы крови.

Результаты исследования могут быть использованы при разработке прибора для инструментального определения групповой принадлежности крови человека.

Литература

1. Vyas G.N. et al. (San Francisco, CA), Simultaneous human ABO and RH(D) blood typing or antibody screening by flow cytometry, United States Patent 5,776,711 July 7, 1998.

2. Sturgeon P. Immunohematology, 17, 4 (2001)

3. Kline T.R., Runyon M.K., Pothiawala M., Ismagilov R.F. Anal Chem., 80(16) 6190-7 (2008)

4. Muranyi I. et al. (Budapest, HU), Blood typing apparatus,United States Patent 4533638, US Patent Issued on August 6, 1985

5. Steven R.A. A Simplified Visible/Near-Infrared Spectrophotometric Approach to Blood Typing for Automated Transfusion Safety, a thesis presented to North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA, (2005).

6. Lambert J.B. A miniaturized device for blood typing using a simplified spectrophotometric approach, a thesis submitted to North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA, (2006).

7. Moncharmont P., Plantier A., Chirat V., Rigal D. Immunohematology, 19(2), 54-6 (2003).

8. Goldfinger Dennis, et al. (Encino, CA), Portable blood typing apparatus and method. United States Patent 4650662, US Patent Issued on March 17, 1987

9. Battrell, C.F. et al., Microfluidic apparatus and methods for performing blood typing and crossmatching. United States Patent, Patent application number: 20100112723, Publication date: 05/06/2010

10. Алипов А.Н., Ванинский В.З., Денисов Л.Б., Донсков С.И., Дубровский В.А., Завьялов Э.Н., Князьков Н.Н. Способ определения реакции агглютинации Авторское свидетельство изобретения. №1683760, приоритет от 04.06.1987, опубликовано Бюл. №38 от 30.10.1991.

11. Doubrovski V.A., Dvoretski K.N. Ultrasound in Medicine & Biology., 26(4), 655 (2000).

12. Дубровский В.А., Дворецкий К.Н., Балаев А.Э. Акустический журнал, 50(2), 184 (2004).

13. Yu. A. Ganilova, V.A. Doubrovski, I. V. Zabenkov, The resolving power of the flowing method to register the process of human erythrocytes agglutination in vitro on the base of correlation analysis of microphotographs. // Proc.SPIE. 2011 V7999. 799903

14. Дубровский В.А., Ганилова Ю.А., Забенков И.В., Применение спектрально фильтрованного зондирующего светового луча и RGB разложения микрофотографий для проточной регистрации агглютинации эритроцитов, усиленной ультразвуком, Оптика и спектроскопия, 2012, принята в печать.

15. Дубровский В. А. , Долмашкин А. А. , Опт. и спектр., 109(2), 1346-50 (2010).

16. Дубровский В.А., Долмашкин А.А., Определение группы крови на основе цифровых фотографий эритроцитов и их агглютинатов, Медицинская техника, 2012, №2, стр. 24-30.

17. Долмашкин А.А., Дубровский В.А., Забенков И.В., Определение группы крови на основе регистрации упругого рассеяния лазерного излучения методом цифровой фотографии, Квантовая электроника, 2012, 42, №5, 409-417.

Таблицы

Таблица 1

Наименование прибора	Фирма	Страна
Galileo Echo ™	ImmucorGamma	США
PK7200® Automated Microplate System	Olympus Diagnostics	Япония
TANGO Benchtop Blood Bank Analyzer	Olympus Diagnostics	Япония
ORTHO AUTOVUE Innova/Ultra System	Ortho-Clinical Diagnostics Johnson & Johnson company	США
ORTHO ProVue™ Automated BloodBank Instrument	Ortho-Clinical Diagnostics Johnson & Johnson company	США
Automatic analyzer WADiana Compact	Diagnostic Grifols S.A.	Испания
Auto Analyzer	Technicon Instrument Corporation	США
Groupamatic	Centre National de Transfusion	Франция
Haemotyper	Tecan	Швейцария

Таблица 2.

Прямая реакция		Обратная реакция
t_возд	60-90 сек	t_возд	30-60 сек
t_инк	90-180 сек	t_инк	60-120 сек
С_эр	1-2 (%)	С_{ст. эр.}	5-12 (%)
С_эр	1-2 (%)	С_пл	10-50 (%)
Оптимальное соотношение «сыворотка- эритроциты»	10:1	Оптимальное соотношение «плазма-ст. эритроциты»	10:1

Рисунки

 Рисунок 1 и 2

Рис.1 Спектры: 1 – поглощения гемоглобина (левая ось ординат); 2 – излучения светодиода (правая ось ординат). Рис.2. Типичные фо

 Рисунок 3 и 4

Зависимость средней яркости пикселя от времени УЗ действия (рис. 3) и от степени разведения исследуемой плазмы (рис. 4) для пол

 Рисунок 5 и 6

Зависимость средней яркости пикселя от степени разведения раствора стандартных (рис.5) и исследуемых эритроцитов (рис.6) для по

Файл

2013-03-3930-A-2642.pdf

Медицинские интернет-конференции

Языки