Проведенный анализ результатов иммуногистохимического исследования 13 моноклональных антител в биопсийном материале 34 больных с раком мочевого пузыря позволяет выявить наиболее значимые иммуногистохимические маркеры предрасположенности к рецидивированию у пациентов с поверхностной формой рака мочевого пузыря.
Несмотря на постоянное усовершенствование методов диагностики и лечения поверхностных форм уротелиальной карциномы к сожалению, не удается сколь нибудь значимо снизить процент рецидивов данных форм рака мочевого пузыря. По данным клинических рекомендаций Европейской ассоциации урологов (2010) прогрессирование опухоли при Та развивается в 6-20% случаев, при Т1 в 27- 48% при любой степени дифференцировки опухолевой ткани.
Большинство исследователей Американской и Европейской урологических ассоциаций, считают ТУР золотым стандартом лечения поверхностного рака мочевого пузыря [1, 9]. Однако, процент рецидивирования поверхностного РМП после выполнения только ТУР МП достаточно высок и составляет в среднем от 51% до 95% [27, Аль-Шукри С.Х. с соавт., 1997; Тарасов Н.И., 2000; Rajala P. et al., 1999; Tolley D.A. et al., 1996], при этом примерно 50% рецидивов возникают в течение 1-го года наблюдения.
Причинами частого рецидивирования поверхностных форм уротелиальной карциномы при органосохраняющей терапии большинство ученых считают следующие:
Западными исследователями было доказано, что высокодифференцированные неинвазивные папиллярные карциномы (рТа) обладают меньшим потенциалом прогрессирования, чем низкодифференцированные с инвазией в субэпителиальную мышечную ткань (рТ1). Вероятность мышечной инвазии в 2 раза меньше у рТа, чем у рТ1 опухолей и составляет 9% и 18% соответственно. Степень дифференцировки также является очень важной характеристикой опухоли. Доказано, что G1 опухоли прогрессируют в 6% случаев, в то время как у G2 опухолей потенциал прогрессирования больше в 5 раз и составляет 30% [22]. При наблюдении за больными в течение 20 лет риск прогрессирования для pTaG1 и pT1G3 был еще выше – 14% и 45% соответственно, при этом рецидивы выявлялись примерно в 50% случаев вне зависимости от степени злокачественности опухоли [19].
С данными результатами исследований согласны и отечественные ученые, которые также считают, что каждый последующий рецидив обладает большим потенциалом злокачественности, следовательно, имеет тенденцию к снижению дифференцировки и к инвазии в мышечный слой (Матвеев Б.П., 2001).
Хорошо известен тот факт, что течение заболевания, опухолевая прогрессия в виде возникновения рецидивов у пациентов с одной и той же клинической стадией и морфологической формой рака часто бывает различным. Поэтому, чтобы понять причины рецидивирования поверхностных форм уротелиального рака и с целью определения потенциала клеток, составляющих опухолевый рецидив, возникла необходимость в проведении дополнительного изучения с помощью иммуногистохимических маркеров.
В отечественной и зарубежной литературе существует много публикаций, в которых единодушно указывается, что уровень экспрессии генов-супрессоров, антигенов пролиферативной активности прямо коррелирует с опухолевой прогрессией и рецидивированием (7, 13). Однако, индексы экспрессии других групп маркеров в мышечнонеинвазивных формах рака (маркеры апоптоза, цитокератины и др.) среди исследователей имеют очень противоречивые результаты.(10)
Следует указать и тот факт, что своевременная молекулярная характеристика рецидивирующей опухоли позволяла бы отбирать больных не только для органосохранного лечения, но и проводить своевременную радикальную цистэктомию пациентам с высоким потенциалом рецидивирования, продлевая им тем самым жизнь.
Все вышесказанное определило цель нашего исследования.
Цель исследования: Выявить наиболее значимые иммуногистохимические маркеры предрасположенности к рецидивированию у пациентов с поверхностной формой рака мочевого пузыря.
Материалы и методы
Материалом для исследования послужили операционный и биопсийный материал 106 пациентов с новообразованиями мочевого пузыря, проходивших лечение в НИИ «Фундаментальной и клинической уронефрологии» ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И.Разумовского Минздрава России. С помощью обзорных методов окрашивания диагноз уротелиального рака был поставлен 94 пациентам. Остальные 12 пациентов составили группу сравнения. Операционный и биопсийный материал фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина и заливали в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм, окрашенные гематоксилин-эозином, были подвергнуты обзорному морфологическому анализу, при котором стадию рака определяли в соответствии с классификацией TNM, а степень дифференцировки опухолевых клеток оценивали в соответствии с рекомендациями ВОЗ, 2004. Микроскопическое изучение препаратов было проведено с применением бинокулярного микроскопа «Micros MC100» при 400-кратном увеличении.
Иммуногистохимические реакции проводили на серийных парафиновых срезах (5мкм), используя стрептавидин-биотиновый метод. В качестве детекционной системы применяли систему LSAB2 System, HRP (K0675), Dako, в качестве хромогена – диаминобензидин (Dako).
Иммуногистохимическое исследование 13 маркеров было проведено на биопсийном и операционном материале. Все используемые моноклональные антитела были разделенны на группы по функциональной значимости:
Интенсивность реакций с антигенами, локализованными в цитоплазме (цитокератины 7,8,13,17,18,19) и на мембранах клеток (EGFR), оценивали полуколичественным способом по балльной шкале от 0 до 3, учитывая выраженность реакции и ее локализацию: 0 – отсутствие реакции, 1 – слабая реакция, 2 – умеренная реакция, 3 – сильная реакция.
Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию (PCNA, Ki67, p53, p63, bcl-2), оценивали по системе подсчета histochemical score. Система подсчета включает в себя интенсивность иммуногистохимической окраски по 3-балльной шкале и долю (%) окрашенных клеток и представляет собой сумму произведений процентов, отражающих долю клеток с различной интенсивностью окраски на балл, соответствующий интенсивности реакции. Интенсивность окраски 0 – нет окрашивания, 1 – слабое окрашивание, 2 – умеренное окрашивание, 3 – сильное окрашивание.
Формула подсчета следующая: histochemical score = ∑ P (i) х I, где i – интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0 до 3; P (i) – процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью. Максимальное значение гистосчета должно соответствовать 300.
Статистический анализ проводили с использованием пакета программ статистической обработки результатов SSPS 13.0 for Windows.
Результаты
Из 104 человек с диагнозом уротелиального рака были отобраны больные у которых РМП имел рецидивирующее течение – 34 человека.
При сравнительной характеристике клинических групп Та иТ1 необходимо отметить, что процент рецидивирующих опухолей резко возрастает с 34% в группе Та до 73% в группе Т1. Практически в половине процентов случаев (44%) рецидивы наблюдались у пациентов, первичная опухоль которых имела мультицентрический характер поражения слизистой мочевого пузыря.
В группе Та все 100% опухолей, которые рецидивировали в последующем, были высокодифференцированными (G1). Разнообразная картина наблюдается среди пациентов группы Т1: преобладали опухоли с высокой степенью злокачественности (G2,3), высокодифференцированные первичные опухоли (G1) наблюдались в 2,5 раза реже.
При анализе показателей экспрессии иммуногистохимических маркеров, имеющих ядерное окрашивание (Ki67, Р53, Р63, PCNA), в группе пациентов Та практически не отличалось от уровня экспрессии пациентов, которые не имели рецидива в последующем. Однако, необходимо отметить пациента, который в анамнезе имел несколько рецидивов (R2): уровень экспрессии всех ядерных маркеров были выше остальных пациентов данной клинической группы.
В группе пациентов Т1 среди больных с рецидивирующими опухолями отмечается существенный рост процента клеток с положительной экспрессией по сравнению с группой Та: среднее количество клеток с положительной экспрессией Ki67 в Та – 4%, в Т1 – 17,5%. Кроме того, необходимо отметить, что раковые клетки с интенсивной иммуногистохимической реакцией маркера Ki67 и р53 появляются только в тех случаях, когда уротелиальная карцинома имела в последующем рецидив. Аналогичная тенденция наблюдается в показателях положительной экспрессии и у остальных ядерных маркеров.
Рис. 1. Уротелиальный рак с инвазией в собственную пластинку слизистой оболочки мочевого пузыря. Умеренная и высокая экспрессия Кi-67 в ядрах уротелия.
Необходимо отметить особенности экспрессии Р53 среди пациентов группы Т1: позитивная экспрессия наблюдалась только у больных в первичной опухоли с рецидивами.
Рис. 2. Умеренная и выраженная экспрессия маркера Р53 в клетках уротелиальной карциномы с инвазией в собственную пластинку слизистой мочевого пузыря.
PCNA в обеих группах показал высокий процент экспрессии без существенных различий среди пациентов с рецидивами и без рецидивов.
При иммуногистохимической реакции на антигены, локализованные в цитоплазме, было установлено, что их экспрессия во всех исследованных группах больных является положительной. Достоверно значимых различий между группами больных по показателям иммуногистохимических реакций с цитокератинами (СК7, СК8, СК10/13, СК17, СК18, СК19) и рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) не установлено.
Маркер Bcl2 не показал достоверной разницы в экспрессии ни в одной из изучаемых групп.
Выводы
Таким образом, проведенные исследования 13 моноклональных иммуногистохимических антител позволили сделать следующие выводы: