Цель: изучить влияние золотых наночастиц на морфофункциональное состояние тимуса в эксперименте. Материал и методы: Эксперимент был поставлен на 72 белых беспородных крысах, разделенных на 4 группы. Животные опытных групп получали перорально золотые наночастицы длительностью 8,16 и 30 суток по соответствующей схеме. Результаты. Пероральное введение наночастиц золота приводит к изменению морфофункционального состояния тимуса. Заключение. Изменения изучаемых показателей носят размерзависимый характер. Выявленные изменения свидетельствуют об активации процессов пролиферации, дифференцировки и миграции лимфоцитов.
В.Ю. Рассказова – ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, студентка 3 курса лечебного факультета; О.В. Злобина – ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, кафедра гистологии, ассистент, кандидат медицинских наук; С.С. Пахомий – ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, ассистент кафедры патологической анатомии; А.Б. Бучарская – ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, руководитель Научно-образовательного центра фундаментальной медицины и нанотехнологий, кандидат биологических наук.
Введение. В настоящее время все большее внимание уделяется изучению проблем нанотехнологий. Возможно, что применение наноматериалов приведет к значительным достижениям в медицине за счет их способности к взаимодействию с тканями. Исследования по применению нанотехнологий в медицине широко распространены. Особенно много работ по использованию и применению наночастиц золота [1]. Их используют в качестве носителей для доставки лекарственных средств при терапии онкологических заболеваний и как собственно лекарственное или диагностическое средство при лечении опухолей. В настоящее время наблюдается разброс данных и выводов по уровням и кинетике биораспределения золотых наночастиц (ЗНЧ) и по оценкам токсичности. Следовательно, имеется настоятельная необходимость в продолжении исследований, связанных с оценками размерных эффектов наночастиц в их биораспределении по органам и воздействии на организм человека, в частности на иммунную систему. В связи с этим особую актуальность приобретают исследования о влиянии ЗНЧ на органы иммунной системы, в частности на тимус.
изучение морфофункционального состояния тимуса лабораторных животных при пероральном введении золотых наночастиц в эксперименте.
В эксперименте использовали ЗНЧ, синтезированные в лаборатории нанобиотехнологии ИБФРМ РАН (г. Саратов): частицы коллоидного золота диаметром 15 и 50 нм с числовой концентрацией 1,3× шт/мл и 3,5× шт/мл соответственно (концентрация золота 57 мкг/мл). Средний размер ЗНЧ определяли по электронно-микроскопическим изображениям на микроскопе Libra-120 . Наночастицы коллоидного золота с размером 15 и 50 нм синтезировали цитратным методом Фрэнса путем восстановления золотохлористо-водородной кислоты (HAuCl4, Sigma-Aldrich, USA) цитратом натрия [1]. Для увеличения биодоступности и биосовместимости наночастицы были конъюгированы с полиэтиленгликолем. Протокол конъюгирования состоял в следующем. К 50 мл суспензии наночастиц добавляли 45 мкл 0,2 М поташа (углекалиевая соль) и 500 мкл 5 мМ метилполиэтиленгликольтиола. В результате ковалентного связывания тиол-групп с поверхностью золотой оболочки образуется конъюгат. Время реакции составляет примерно 10 часов. Полученные конъюгаты отмывали от избытка продуктов реакции двукратным центрифугированием и ресуспендированием в 0,9%-ном растворе хлорида натрия.
Эксперимент был поставлен на 72 белых беспородных крысах мужского пола массой 180-220 г. Животные во время эксперимента содержались в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе. Для устранения влияния сезонной циркадной зависимости эксперименты проводились в осенне-зимний период во второй половине дня. Все животные при проведении эксперимента находились в равных условиях. Опыты проводились в отдельной лаборатории при постоянной температуре со стандартным уровнем освещения, исключающим посторонние раздражители. Эксперименты на животных проводились в соответствии с Женевской конвенцией «International Guiding principles for Biomedical Research Involving Animals» (Женева,1990) и Хельсинкской декларацией (1975).
Исследование проводилось на четырех группах животных, в каждой группе по 6 особей. Первая группа – контрольная, вторая, третья и четвертая – опытные. Крысам опытных групп вводили перорально ЗНЧ размерами 1-3 нм, 15 нм и 50 нм длительностью введения 8, 16 и 30 суток из расчета 190 мкг/кг массы животного. Крысам контрольной группы через день вводили перорально по 1 мл физиологического раствора. Забор материала осуществляли через 24 часа после последнего введения [2]. Для гистологического исследования готовились серийные срезы тимусов толщиной 5-7 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином. Фотосъемка препаратов проводилась с помощью цифровой фотокамеры Canon IXUS 115 HS. Подсчет корково-мозгового индекса проводился с помощью морфометрической программы ImageJ. Для изучаемого параметра определяли значения средней арифметической, ошибку средней арифметической. Достоверность различий между средними величинами (р) определяли по t-критерию Стьюдента.
Эксперимент показал, что на разные сутки исследования отмечается изменение значений корково-мозгового индекса по сравнению с контрольной группой. При введении ЗНЧ на 8-е сутки размерами 1-3нм и 50 нм значение корково-мозгового индекса незначительно отличается от контрольной группы (соответственно 2,07±0,6 и 2,08±0,04, при контроле 2,08±0,14 р<0,05). При введении ЗНЧ размером 15 нм нами было замечено уменьшение показателя на 0,27( 2,08±0,04 при 2,08±0,14 в контроле, р<0,05). На 16-е сутки при введении ЗНЧ размерами 1-3 нм и 50 нм значение изучаемого показателя незначительно отличалось от контрольной группы. При введении ЗНЧ размером 15 нм нами было замечено уменьшение значения изучаемого показателя на 0,32 по сравнению с контролем. На 30-е сутки отмечалось незначительное колебание показателя при введении ЗНЧ размерами 15нм и 50 нм и небольшое уменьшение изучаемого показателя при введении ЗНЧ размером 1-3 нм (на 0,99 по сравнению с контролем). При введении ЗНЧ размерами 1-3 нм, 15 нм, 50 нм отмечается уменьшение лимфоцитов в мозговом веществе тимуса на 8-е сутки: 740±44, 725±55, 733±16 (при контроле 908±21, р<0,05). Наибольшее уменьшение количества лимфоцитов наблюдается при введении ЗНЧ размером 15 нм (725±55 при контроле 908±21, р<0,05). На 16-е сутки отмечается увеличение лимфоцитов при введении ЗНЧ размером 15 нм (983±5 , контроль 908±21, р<0,05 ). На 30-е сутки нами было замечено уменьшение значений исследуемого показателя при введении ЗНЧ различных размеров. При анализе степени насыщенности лимфоцитами коркового вещества нами были получены следующие результаты на 8-е сутки при введении ЗНЧ размерами 1-3 нм, 15 нм и 50 нм: 871±72, 955±14, 837,5±7,5 (при контроле 861±36, р<0,05). При введении ЗНЧ размером 15 нм на 8-е сутки было отмечено значительное увеличение изучаемого показателя: 955±14 (при контроле 861±36, р<0,05). На 16-е сутки отмечается уменьшение исследуемого показателя при введении ЗНЧ размерами 1-3 нм. На 30-е сутки нами было замечено уменьшение значений исследуемого показателя при введении ЗНЧ различных размеров (табл. 1-3).
Тимус является центральным органом иммунопоэза. От его функционального состояния и активности во многом зависит степень выраженности защитных реакций всего организма. Сведений о воздействии наночастиц золота на пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов в тимусе крайне мало. В работе [3] наночастицы использовались как носители антигенов. Было установлено, что инъекционное введение лабораторным животным коллоидного золота может приводить к его накоплению в ретикулярных клетках лимфоидной ткани, активации клеточного и гуморального иммунитета за счет стимуляции фагоцитирующей активности макрофагов и лимфоцитов, что может обуславливать их иммуномодулирующий эффект. Кроме того, было установлено, что золотые наночастицы стимулируют дыхательную активность клеток ретикулоэндотелиальной системы и активность митохондриальных ферментов макрофагов, что, возможно, является одной из причин адъювантных свойств коллоидного золота. Кроме того, ЗНЧ, конъюгированные с антигенами, влияют на активацию Т-клеток, о чем свидетельствует увеличение степени их пролиферации в 10 раз [4]. Изучено влияние неконъюгированного коллоидного золота на иммунокомпетентные клетки in vivo [5] и показано, что введение мышам ЗНЧ вызывает усиление пролиферации лимфоцитов и нормальных киллеров, увеличение выработки интерлейкина II.
Кроме того, интересным является установленный факт размерзависимой цитотоксичности ЗНЧ: известна выраженная цитотоксичность лишь для частиц размером 1,4 нм, но никак не для частиц размером 15 нм [6].
Анализируя различные данные, можно прийти к заключению о том, что в тимусе отмечаются признаки активации процессов пролиферации, дифференцировки и миграции лимфоцитов. Это выражается в увеличении количества лимфоцитов в корковом и мозговом веществе тимуса при введении ЗНЧ размером 15 нм. Описанное морфофункциональное состояние тимуса согласуется с литературными данными о цитологических изменениях центральных органов иммуногенеза под влиянием различных воздействий.
Резюмируя изложенные данные, можно прийти к заключению о том, что пероральное введение ЗНЧ размером 1-3 нм, 15 нм и 50 нм приводит к изменению морфофункционального состояния тимуса, а именно к изменению значений корково-мозгового индекса, степени насыщенности лимфоцитами коркового и мозгового вещества. Изменения названных показателей носят размерзависимый характер. Подсчет корково-мозгового индекса выявил некоторое снижение этого показателя на 8-е и 16-е сутки при введении ЗНЧ размером 15 нм с тенденцией к его увеличению на 30-е сутки эксперимента. Что касается ЗНЧ размером 1-3 нм и 50 нм, следует отметить незначительные колебания изучаемого показателя при введении ЗНЧ соответствующих размеров. Изменение степени насыщенности клетками тимуса под влиянием ЗНЧ имеет определенную временную динамику: на 8-е сутки отмечается уменьшение клеток в мозговом и корковом веществе при введении ЗНЧ размерами 1-3, 15 и 50 нм и увеличение клеток в корковом веществе при введении ЗНЧ размером 15 нм, что свидетельствует о стимулирующем влиянии ЗНЧ размером 15 нм на пролиферацию и дифференцировку тимоцитов. Кроме того, на 16-е сутки отмечается увеличение количества клеток в мозговом веществе, что свидетельствует о стимуляции процессов миграции в тимусе.
Конфликт интересов. Работа выполнена в рамках программы НИР кафедры гистологии СарГМУ.
Таблица 1. Результаты подсчета на 8-е сутки
|
Показатели |
Контроль |
1-3 нм |
15 нм |
50 нм |
|
Корково-мозговой индекс |
2,08±0,14 |
2,07±0,6 |
1,81±0,7 |
2,08±0,04 |
|
Степень насыщенности лимфоцитами мозгового вещества |
908±21 |
740±44 |
725±55 |
733±16 |
|
3Степень насыщенности клетками коркового вещества |
861±36 |
871±72 |
955±14 |
837,5±7,5 |
Таблица 2.Результаты подсчета на 16-е сутки
|
Показатели |
Контроль |
1-3 нм |
15 нм |
50 нм |
|
Корково-мозговой индекс |
2,08±0,14 |
1,9±0,22 |
1,76±0,01 |
2,2±0,6 |
|
Степень насыщенности лимфоцитами мозгового вещества |
908±21 |
911±18 |
983±5 |
946±40 |
|
Степень насыщенности лимфоцитами коркового вещества |
861±36 |
773±25 |
895±26 |
873±51 |
Таблица 3. Результаты подсчета на 30-е сутки
|
Показатели |
Контроль |
1-3 нм |
15 нм |
50 нм |
|
Корково-мозговой индекс |
2,08±0,14 |
1,9±0,62 |
2,09±0,4 |
2,01±0,92 |
|
Степень насыщенности лимфоцитами мозгового вещества |
908±21 |
879±56 |
848±26 |
871±74 |
|
Степень насыщенности лимфоцитами коркового вещества |
861±36 |
767±66 |
719±47 |
792±77 |
Русский
English