Русский
EnglishМорфологические изменения в почках при различных способах введения покрытых и непокрытых наночастиц железа
ID: 2014-01-1276-A-3313
Оригинальная статья
ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава России, НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии
Резюме
.
Ключевые слова
наночастицs железа, почки
Введение
Железные наночастицы (НЧ), в частности оксидов железа, обладающие магнитными свойствами, уже широко применяются для биомедицинских целей in vivo, например, для усиления контрастирования и повышения диагностической чувствительности в МРТ [6,7], целевой доставки и специфического связывания терапевтических агентов в биоткани [8], гипертермии с помощью переменного магнитного поля, тканевой инженерии [2,10]. На сегодня недостаточно освещены вопросы изучения накопления и морфологических изменений во внутренних органах при различных методах введения НЧ, хотя есть работы, посвященные пероральному, внутримышечному введению нестабилизированных НЧ, показавшие, что данные методы не эффективны для диагностики и последующего лечения опухолей и оказывают умеренно выраженный токсический эффект на внутренние органы [1,3-5,9]. Так как одним из основных органов выведения продуктов обмена, в том числе лекарственных веществ, являются почки, нами было принято решение изучить влияние наночастиц на данный орган.
Цель
изучение морфометрических и морфологических изменений почек лабораторных крыс, в том числе и с перевитым раком печени РС-1, при различных дозировках и путях введения непокрытых НЧ железа и стабилизированных цитратом.
Материал и методы
В экспериментах использовались белые беспородные крысы-самцы весом 180–200 г, интактные и с перевитой опухолью – рак печени РС-1 (опухолевый штамм получен в РОНЦ им.Н.Н. Блохина). Работа с лабораторными животными осуществлялась согласно протоколу исследований в соответствии с Женевской конвенцией 1985 г. и Хельсинкской декларацией 2000 г. о гуманном отношении к животным. Было проведено 5 серий экспериментов.
1 серия – изучение морфологических изменений в почках лабораторных животных при однократном внутримышечном и пероральном введении не покрытых оболочкой наночастиц железа и стабилизированных цитратом наночастиц железа. В каждой группе было по 10 животных, всего было введено 5 групп. В первой группе каждая крыса получала по одной внутримышечной инъекции непокрытых, а во второй – цитрат-стабилизированных наночастиц железа в каждое бедро в дозировке 7,4 мг/кг. В третьей и четвертой группах аналогично животные получали наночастицы железа в дозировке 14,8 мг/кг. Пятая группа была контрольной, в которой животные получали инъекцию 1 мл физиологического раствора.
2 серия – изучение морфологических изменений во внутренних органах при однократном пероральном введении непокрытых и стабилизированных цитратом наночастиц железа в дозировке 4,5 мг/кг. В контрольной группе 10 крыс получали однократно 1 мл физиологического раствора.
Через 24 часа после введения все животные выводились из эксперимента путем декапитации, забирались почки для гистологических исследований.
3 серия – животные были разделены на 3 опытные группы по 10 крыс в каждой, получавших в течение 7 дней перорально раствор наночастиц железа (Fe3O4, 20 nm ± 10), Zp = -30 mv, покрытых цитратной оболочкой, в дозировке 250 мкг/кг, 500 мкг/кг и 1000 мкг/кг. Группа сравнения (10 особей) получала в течение 7 дней перорально 1 мл физиологического раствора, затем на 8 сутки крысам с перевитой опухолью рака печени РС-1 проводилось исследование методом магнитно-резонансной томографии, затем все животные выводились из эксперимента путем декапитации, забирались внутренние органы и опухоль для гистологических исследований.
4 серия – изучение морфологических изменений во внутренних органах и перевитой опухоли в 4-х группах лабораторных животных при однократном и многократном внутрибрюшинном введении наночастиц железа, покрытых цитратной оболочкой, – по 10 крыс с перевиваемой опухолью рака печени РС-1в каждой.
1-я группа: вводили раствор наночастиц железа (Fe3O4, 20 nm ± 10), Zp = -30 mv, покрытых цитратной оболочкой, в дозировке 1000 мкг/кг однократно внутрибрюшинно;
2-я группа: в течение 7 дней внутрибрюшинно в дозировке 250 мкг/кг. Две группы сравнения, каждая состоящая из 10 белых беспородных крыс с перевитым раком печени РС-1, получали внутрибрюшинно инъекцию 1мл физиологического раствора либо однократно, либо в течение 7 дней. Затем животные, получавшие однократное введение, выводились из эксперимента через 1 сутки. Животным с многократным введением на 8-е сутки проводилось исследование методом магнитно-резонансной томографии, и животные выводились из эксперимента путем декапитации, забирались внутренние органы и опухоль для гистологических исследований.
5 серия – изучение морфологических изменений во внутренних органах и перевитой опухоли лабораторных животных при однократном внутривенном введении наночастиц железа, покрытых цитратной оболочкой. В 5-й серии эксперимента 2 группы крыс с перевиваемой опухолью рака печени РС-1 получили однократно внутривенно раствор наночастиц железа (Fe3O4, 20 nm ± 10), Zp = -30 mv, покрытых цитратной оболочкой: 1-я группа – в дозировке 0,2 мг/кг; 2-я – в дозировке 16 мг/кг. Третья группа (сравнения) получила однократно внутривенно 1мл физиологического раствора. В каждой группе было по 10 крыс. На 2-е сутки крысам проводилось исследование методом магнитно-резонансной томографии, и животные выводились из эксперимента путем декапитации, забирались внутренние органы и опухоль для гистологических исследований.
Для оценки качественных изменений в органах (выраженность полнокровия, отека, дистрофии, феномена сепарации крови и эмфиземы легких) применялась полуколичественная оценка в баллах, в зависимости от выраженности признака, от 0 до 3-х баллов: 0 – отсутствие признака,1 балл – слабо выраженный признак, 2 балла – умеренно выраженный признак, 3 балла – выраженный признак. В почках измеряли высоту эпителия извитых канальцев, периметр и площадь клубочков.
Все морфометрические исследования и фотографирование проводились в 10 полях зрения при увеличении 774 с помощью Микровизора медицинского проходящего света µVizo-101 (ЛОМО).
Для обработки полученных в ходе исследований данных был использован пакет прикладных статистических программ «SPPS 17.0». Представленная статистическая обработка данных заключалась в проверке соответствия формы распределения количественных признаков нормальному с помощью применения теста Колмогорова-Смирнова. Нулевую гипотезу отвергали в случае р<0,05. Для каждого показателя в исследуемых группах вычисляли среднее арифметическое (М), среднюю ошибку среднего арифметического (m), среднеквадратичное отклонение (σ). Показатель достоверности различий (Р) определялся с использованием критериев Стьюдента (t). Различия оценивались как достоверные при вероятности 95% (Р<0,05) и выше.
Результаты
При внутримышечном введении непокрытых наночастиц отмечали увеличение полнокровия сосудов коркового вещества. При внутримышечном введении покрытых цитратомнаночастиц, так же, как и непокрытых, отмечали увеличение полнокровия сосудов коркового вещества, появление зернистой дистрофии эпителиоцитов извитых канальцев, а также некоторое уменьшение просвета между капсулой Шумлянского-Боумена и сосудистыми петлями клубочка.
При анализе морфометрических показателей в почках установлено, что однократное внутримышечное введение непокрытых наночастиц железа как в дозировке 7,4 мг/кг, так и в дозировке 14,8 мг/кг не приводит к статистически значимому увеличению размеров клубочков по площади и по периметру. Однако статистически значимо увеличивалась высота эпителиоцитов извитых канальцев: в 2 и 2,7 раза при соответствующих дозировках 7,4 мг/кг и 14,8 мг/кг за счет развития дистрофических изменений. Однократное внутримышечное введение покрытых цитратом наночастиц железа приводит к незначительному уменьшению размеров клубочков и статистически значимому увеличению средней высоты эпителиоцитов извитых канальцев, которое зависит от вводимой дозировки (табл.1).
При однократном пероральном введении наночастиц железа отмечали увеличение полнокровия сосудов коркового и мозгового вещества по сравнению с контролем и развитие зернистой дистрофии эпителиоцитов извитых канальцев. В почках при однократном пероральном введении наночастиц железа отмечали увеличение полнокровия сосудов коркового и мозгового вещества по сравнению с контролем.
При анализе морфометрических показателей в почках было установлено, что однократное пероральное введение непокрытых наночастиц железа в дозировке 4,5 мг/кг приводит к статистически значимому увеличению размеров клубочков, а также увеличению средней высоты эпителиоцитов извитых канальцев по сравнению с контролем Однократное пероральное введение покрытых цитратом наночастиц железа в дозировке 4,5 мг/кг приводит только к статистически значимому увеличению в 2 разасредней высоты эпителиоцитов извитых канальцев за счет развития дистрофических изменений (табл. 1).
При многократном пероральном введении покрытых наночастиц железа корковое и мозговое вещество имели нормальное строение, клеточной инфильтрации не выявлено, уротелий не был изменен. Обращало на себя внимание полнокровие сосудов мозгового вещества и клубочков при дозировках 500 и 1000 мкг/кг; развивалась зернистая дистрофия эпителиоцитов извитых и прямых канальцев по мере увеличения дозировки, а также увеличивался просвет между клубочком и капсулой Шумлянского-Боумена по сравнению с группой сравнения.
При анализе морфометрических показателей в почках мы установили, что длительное введение наночастиц железа в дозировке 250 мкг/кг не приводило к статистически значимым изменениям размеров клубочков и эпителиоцитов извитых канальцев. При длительном введении наночастиц железа в дозировках 500 и 1000 мкг/кг наблюдали уменьшение размеров клубочков по площади и увеличение высоты эпителиоцитов в среднем в 1,6 раза (табл. 1).
При однократном внутрибрюшинным введении наночастиц наблюдали полнокровие сосудов коркового и мозгового вещества и интерстициальной зоны, феномен сепарации крови в крупных сосудах, зернистую дистрофию извитых и прямых канальцев, расширенные собирательные трубочки. Просвет капсулы Шумлянского-Боумена был свободен, кровенаполнение клубочков снижено по сравнению с контролем. Уротелий почечной лоханки в норме. При многократном внутрибрюшинном введении наночастиц в почках обнаружили полнокровие сосудов мозгового вещества, единичные периваскулярные кровоизлияния, набухание и зернистую дистрофию эпителия извитых и прямых канальцев. Просвет капсулы Шумлянского-Боумена был также свободен, отмечали малокровие клубочков по сравнению с контролем. Уротелий почечной лоханки был не изменен.
При анализе морфометрических показателей при однократном внутрибрюшинном введении отмечали статистически значимое снижение размеров клубочков по площади на 15,5%, по периметру на 11% и увеличение средней высоты эпителиоцитов извитых канальцев на 16% по сравнению с контрольной группой; при многократном внутрибрюшинном введении наночастиц статистически значимое увеличение размеров клубочков – только по периметру на 5%, статистически значимого изменения средней высоты эпителиоцитов извитых канальцев по сравнению с контрольной группой не наблюдали(табл. 1).
При внутривенном введении цитрат-стабилизированных наночастиц железа мы отмечали, что структура коркового и мозгового вещества имела обычное строение, клеточной инфильтрации не выявлялось, уротелий не изменен, развивался феномен сепарации крови в крупных сосудах. К статистически значимым морфологическим изменениям, выявленным в почке, относились: увеличение полнокровия сосудов мозгового вещества и клубочков, выраженная зернистая дистрофия эпителия извитых канальцев, уменьшение просвета между клубочком и капсулой Шумлянского-Боумена по сравнению с контролем. Встречались единичные некротизированные эпителиоциты извитых канальцев.
При анализе морфометрических данных структурных элементов почки после введения покрытых наночастиц железа в дозировке 20 мкг/кг было установлено статистически значимое по сравнению с группой сравнения уменьшение размеров клубочков, а также увеличение высоты эпителиоцитов извитых канальцев из-за развития в них выраженной дистрофии. При дозировке 16 мг/кг в почках развивались такие же процессы, как и при предыдущей дозировке (рис.1,табл.1).
Рис.1А. Увеличение высоты эпителиоцитов извитых канальцев после однократного внутривенного введения наночастиц железа в дозировке 20 мкг/кг. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 774.
Рис. 1Б. Феномен сепарации крови в сосуде крупного калибра после однократного внутривенного введения наночастиц железа в дозировке 16 мг/кг. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 246,4.
Обсуждение
При однократном введении в почках непокрытые частицы вызывают увеличение площади клубочков и в меньшей степени – высоты эпителиоцитов извитых канальцев, в то время как покрытые наночастицы несколько уменьшают площадь клубочков и увеличивают высоту эпителиоцитов извитых канальцев. Возможно, это обусловлено тем, что непокрытые частицы образуют более крупные агрегаты, чем отдельно воздействующие стабилизированные частицы, и поэтому их взаимодействие с клетками меняется.
При многократном пероральном введении покрытых цитратом наночастиц изменения носили дозозависимый характер. С увеличением дозировки нарастала степень полнокровия сосудов коркового, мозгового вещества почек и клубочков, дистрофия эпителиоцитов извитых и прямых канальцев. Введение наночастиц в дозировке 250 мкг/кг не влияло на размеры клубочков и высоту эпителиоцитов извитых канальцев, в то время как дозировка в 500 мкг/кг приводила к увеличению высоты эпителиоцитов извитых канальцев.
При внутрибрюшинном введении обращало на себя внимание то, что выраженность изменений в большей степени зависело от дозировки и в меньшей – от длительности введения.
При внутривенном введении дистрофические изменения в эпителии извитых канальцев могли возникать, в первую очередь, за счет токсического влияния опухоли.Развитие коллапса клубочков, что было подтверждено морфометрически, возможно, связано с циркуляцией в кровотоке наночастиц.И.В. Мильто, Г.А. Михайлов, А.В. Ратькин и соавт. (1980), изучавшие морфологию почек крыс при внутривенном введении наночастиц Fe3O4, отмечали также полнокровие сосудов мозгового вещества и расширение капсулы Шумлянского-Боумена, которого в нашем эксперименте мы не наблюдали, что может быть обусловлено другим размером и покрытием наночастиц.
Заключение
Непокрытые частицы за счет образования конгломератов больше влияют на изменения размеров клубочков, приводя к их увеличению за счет полнокровия, в то время как цитрат-стабилизированные частицы вызывают дистрофию извитых канальцев с увеличением высоты эпителиоцитов, что, возможно, приводит к сдавлению клубочков. Таким образом, морфологические изменения в почках при введении наночастиц железа в большей степени зависят от дозировки и наличия покрытия, чем от длительности их введения, так как наличие цитратной оболочки способствует их стабилизации в кровотоке и тканях и большей биосовместимости, что и определяет их меньшую токсичность.
Литература
- Динамика морфологических и биохимических изменений у лабораторных животных с перевитым раком почки при внутривенном введении золотых нанооболочек / Н. А. Наволокин, Г. Н. Маслякова, А. Б. Бучарская, Л. В. Сулейманова, С. М. Кун, Г. С. Терентюк, Н. Г. Хлебцов, Б. Н. Хлебцов // Известия Саратовского государственного университета. Сер. Физика. 2012. Т. 12, № 2. С. 37-43.
- Синтез гидрозолей магнетита и их воздействие на живые системы на клеточном и тканевом уровнях / С. В. Герман, О. А. Иноземцева, Н. А. Наволокин, А. В. Маркин, Е. Е. Пудовкина, П. О.Петров, Е. С.Тучина, А. Б. Бучарская, С. Н. Плескова, Г. К. Маслякова, Д. А. Горин // Российские нанотехнологии. 2013. № 7-8. С. 118-123.
- Морфологические изменения во внутренних органах лабораторных животных при однократном введении наночастиц Fe / Н. А. Наволокин, О. В. Матвеева, Г. Н. Маслякова, А. Б. Бучарская, Л. В. Сулейманова, С. М. Кун, Б. А. Медведев, А. А. Игнатьев, Т. В. Бочкарёва // Известия Саратовского государственного университета. Сер. Физика. 2011. Т. 11, № 2. С. 62-66.
- Наволокин Н. А., Кун С. М. Морфологические изменения внутренних органов и головного мозга при пролонгированном пероральном введении наночастиц железа //Саратовский научно-медицинский журнал. 2011. Т. 7, № 4. С. 760-762.
- Применение морфологических методов исследования в наноонкологии / Г. Н. Маслякова, А. Б. Бучарская, Н. А. Наволокин, А. А. Широков, А. М. Буров // Вестник биотерапевтического журнала. 2011. № 4. С. 104.
- Chouly C., Pouliquen D., Lucet I., Jeune J. J., Jallet P. Development of superparamagnetic nanoparticles for MRI: effect of particle size, charge and surface nature on biodistribution // J. Microencapsulation. 1996. Vol. 13. P. 245.
- Gupta A. K, Curtis A. S. G. Lactoferrin and ceruloplasmin derivatized superparamagneticiron oxide nanoparticles for targeting cell surface receptors // Biomaterials. 2004. Vol. 25. P. 3029.
- Jun Y., Lee J.-H., Cheon J. Chemical Design of Nanoparticle Probes for High-Performance Magnetic Resonance Imaging // Angewandte Chemie International Edition. 2008. Vol. 47. P. 5122.
- Navolokin N. A., Maslyakova G. N., Bucharskya A. B., Kong X. M. Morphological changes in the kidney, liver and spleen during prolonged administration of iron nanoparticles // Journal of Physics: Conference Series. 2012. Vol. 345. № 012043. doi:10.1088/1742-6596/345/1/012043.
- Reimer P., Weissleder R. Development and experimental application of receptor-specific MR contrast media // Radiologe. 1996. Vol. 36. P. 153.
Таблицы
Таблица 1. Морфометрические изменения в почках при разных способах введения наночастиц железа
|
Группа |
Дозировка |
Sклубочков (мм2) |
P клубочков (мм) |
Высота эпителиоцитов (мм) |
|
|
Контроль |
- |
0,017±0,0042 |
0,52±0,0066 |
0,0055±0,0002 |
|
|
В/мышечное введение Непокрытые НЧ железа |
7,4 мг/кг |
0,016±0,004 |
0,54±0,05 |
0,011±0,0006 *** |
|
|
14,8 мг/кг |
0,018±0,003 |
0,65±0,041 |
0,015±0,0007 *** |
||
|
В/мышечное введение Покрытые НЧ железа |
7,4 мг/кг |
0,0026±0,0008 ** |
0,195 ±0,04 *** |
0,01±0,0004 ** |
|
|
14,8 мг/кг |
0,0032±0,00021 |
0,222±0,0064 |
0,015±0,0007 *** |
||
|
Пероральное однократное введение Непокрытые НЧ железа |
4,5 мг/кг |
0,27±0,08 *** |
1,88±0,377 *** |
0,04±0,004 *** |
|
|
Пероральное однократное введение Покрытые НЧ железа |
4,5 мг/кг |
0,0031±0,0001 |
0,21±0,006 |
0,019±0,001 *** |
|
|
Группа сравнения пероральное введение |
0,0039±0,00018 |
0,232±0,0054 |
0,012±0,0003 |
||
|
Многократное пероральное введение Покрытые НЧ |
250 мкг/кг |
0,0031±0,0001 |
0,209±0,0055 |
0,0099±0,0002 |
|
|
500 мкг/кг |
0,0025±0,00015 * |
0,18±0,0049 * |
0,018±0,0003 * |
||
|
1000 мкг/кг |
0,0021±0,00006 * |
0,18±0,002 * |
0,015±0,00034 * |
||
|
Группа сравнения внутрибрюшинное введение |
0,0039±0,00018 |
0,232±0,0054 |
0,012±0,0003 |
||
|
Однократное внутрибрюшинное введение Покрытые НЧ Fe |
0,0033±0,0002 *** |
0,208±0,009 ** |
0,014±0,0002 * |
||
|
Многократное внутрибрюшинное введение Покрытые НЧ Fe |
0,0034±0,0001 |
0,22±0,00507 ** |
0,011±0,0002 |
||
|
Группа сравнения |
0,0096±0,00038 |
0,3673±0,00634 |
0,0099±0,00025 |
||
|
Однократное в/венное введение Покрытые НЧ Fe |
20 мкг/кг |
0,0063±0,00016 *** |
0,302±0,00388 *** |
0,0179±0,00031 *** |
|
|
Многократное в/венное введение Покрытые НЧ Fe |
16 мг/кг |
0,0073±0,0005 *** |
0,3±0,011 *** |
0,017±0,00049 *** |
|
Примечание: * — различия значимы при сравнении значений опытной и контрольной групп или группы сравнения при Р<0,05;** — различия значимы при сравнении значений опытной и контрольной групп или группы сравнения при Р<0,005;*** — различия значимы при сравнении значений опытной или группы сравнения при Р<0,001
