Skip to Content

Исследование влияния цветности гемагглютинирующих сывороток на разрешающую способность акусто-оптического метода определения группы крови человека

ID: 2014-03-3930-A-3585
Оригинальная статья (свободная структура)
ГБОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Минздрава РФ

Резюме

Настоящая работа посвящена дальнейшему изучению ранее предложенного акусто-оптического метода определения групповой принадлежности крови человека перекрестным методом. Известно, что производимые центрами крови гемагглютинирующие сыворотки системы ABO имеют различную специальную окраску. В случае применения фотометрического подхода для регистрации реакции агглютинации этот фактор может привести к существенному искажению результатов наблюдений. Таким образом, с учетом этого фактора, при регистрации реакции агглютинации следует производить соответствующую корректировку интенсивности зондирующего светового потока. В настоящей работы был проведен поиск оптимальных условий для корректировки регистрации реакции агглютинации эритроцитов как для прямой так и для обратной компоненты перекрестного метода. Также было показано, что соотвествующая корректировка интенсивности светового потока приводит к существенному повышению разрешающей способности исследуемого акусто-оптического метода типирования крови, а также к повышению надежности результатов. Данное исследование может быть использовано при разработке прибора для инструментального определения групповой принадлежности крови человека.

Ключевые слова

ABO, определение группы крови, агглютинация, эритроцит, седиментация, RGB разложение

Статья

1. Введение

Автоматизация определения группы крови человека по системе ABO и Rh  является актуальной задачей в связи большой частотностью этого вида лабораторного теста. 

Существует немало теоретических и экспериментальных работ, направленных на усовершенствование имеющихся и разработку новых принципов конструирования подобных устройств, например, [1-9]. Одной из основных проблем, решаемых авторами, является повышение «разрешающей  способности» (разрешение) разрабатываемого метода определения группы крови. Напомним, что под разрешающей способностью обычно понимают отношение измеряемого сигнала P+, соответствующего положительной реакции агглютинации (эритроцитарные агглютинаты образуются), к уровню сигнала P- для отрицательной реакции агглютинации (формирование агглютинатов отсутствует). Очевидно, что увеличение разрешающей способности R = P+/P- повышает надежность определения группы крови. Чрезвычайно важно отметить, что ошибка в определении группы крови образца должна исключаться абсолютно, единственное послабление прибору – в некоторых случаях он может не определить группу крови анализируемой пробы.

С целью повышения разрешения оптических методов регистрации реакции агглютинации эритроцитов в [10] было предложено использовать действие стоячей ультразвуковой (УЗ) волны на смесь «кровь-сыворотка-физиологический раствор». При облучении раствора такой смеси ультразвуком «кровь-сыворотка-физиологический раствор» в кювете образуется стоячая УЗ волна, которая приводила к группировке эритроцитов и их комплексов в области узлов. В результате взвесь клеток крови расслаивалась с пространственным периодом, равным половине ультразвуковой длины волны (λ/2). Сближение эритроцитов в узловых областях приводит к увеличению вероятности их взаимодействия, а следовательно, агглютинации при положительной реакции. При этом возрастают как скорость реакции агглютинации, так и размеры иммунных эритроцитарных комплексов и, как результат, скорость седиментации агглютинатов при выключении УЗ генератора (окончание эффекта левитации эритроцитов и агглютинатов). Оптически исследуемая среда становимтся более прозрачной.

При отрицательной реакции агглютинации эритроциты также группируются в узловых областях, формируются «неспецифические» аггрегаты, которые рассыпаются на отдельные эритроциты при выключении ультразвука. Естественно, скорость оседания «свободных» эритроцитов значительно ниже, чем агглютинатов, среда длительное время остается мутной. Различие в величине коэффициента пропускания исследуемых образцов для положительной и отрицательной реакций соответственно несет информацию о том, состоялась реакция агглютинации или нет, что используется для определения группы крови образца. Этот метод получил название «акусто-оптическкий метод регистрации аглютинации эритроцитов, а, следовательно, определения группы крови. Он основан на сочетании действия ультразвука на реакционную смесь «кровь-сыворотка» с оптическим ее зондированием. Детально механизм взаимодействия смеси «кровь-сыворотка» с ультразвуком рассмотрен в [11,12]. Регистрация укрупненных с помощью ультразвука агглютинатов методом проточной цитометрии осуществлена в [13,14], а турбидиметрически с использованием явления седиментации в [15-20].

Представляется важным отметить, что гемагглютинирующие сыворотки системы ABO, производимые центрами крови, имеют различную специальную окраску. Это технологически делается для того, чтобы при типировании крови не допустить ошибку в использовании той или иной сыворотки, а, следовательно, ошибки в определении группы крови. Естественно, различная окраска сывороток вносит некоторую ошибку в фотометрической регистрации седиментации эритроцитов и/или их агглютинатов. Причем эта ошибка различна для различных сывороток, наиболее сильно это проявляется при регистрации положительной реакции агглютинации. Представляется очевидным, что и величина разрешения R должна зависеть от типа образца крови, иммунологического соответствия пары – «кровь-сыворотка», агглютинационной активности эритроцитов и др., но не должна зависеть от характера окраски сыворотки. Задачей настоящей работы является изучение влияния окрашенности агглютинирующих сывороток на величину разрешающей способности акусто-оптического метода, а следовательно, достоверности определения группы крови образца. 

2. Объект исследования, технология пробоподготовки, техника экспериментов

Объектом исследования являлась донорская кровь четырех групп по системе ABO, соответствующие агглютинирующие сыворотки. Образцы донорской крови подвергались центрифугированию (3000 обор/мин, 5 минут), затем эритроцитарная масса использовалась для определения группы крови образца при помощи прямой компоненты перекрестного метода определения группы крови. Прямая составляющая перекрестного метода определения групповой принадлежности крови человека заключается в анализе эритроцитов донора при помощи стандартных гемагглютинирующих сывороток. Цельная кровь или предварительно разбавленные физиологическим раствором эритроциты донора, пациента смешиваются с сыворотками I, II, III и, в случае необходимости, и с сывороткой IV группы крови. Наблюдая за тем, в каких пробах наступила реакция агглютинации, лаборант, производящий исследование, определяет группу крови. Обратная компонента перекрестного метода заключается в анализе плазмы донора, пациента при помощи стандартных эритроцитов. Плазма крови смешивается со стандартными эритроцитами I, II и III групп, и затем, в зависимости от того, в каких пробах наступила реакция агглютинации, лаборант, проводящий исследование, определяет группу исследуемой крови. Комплекс предварительных экспериментов [18, 19] выявил оптимальные условия для наблюдения реакции агглютинации эритроцитов для обеих компонент перекрестного метода. Для прямого метода оптимальными являются: соотношение «стандартная сыворотка»/«исследуемые эритроциты» равное 17 : 1, при условии, что эритроцитарная масса разбавляется физиологическим раствором в соотношении 1:78. В этом случае объемная доля эритроцитарной массы в растворе составляет 1,05 %, а объемная доля стандартной сыворотки - 17,8 %. Измерение спектров поглощения образцов осуществлялось с помощью спектрометра USB 4000-VIS-IR (фирма Оcean Optics, USA) с использованием  кюветы прямоугольной формы толщиной зазора 1 мм.

Регистрация седиментации эритроцитов и их агглютинатов осуществлялась с помощью оптической установки (рис. 1) . Спектр светодиода LXHL-G1S соответствовал спектру поглощения гемоглобина в зеленой области (рис. 2). Для определения групповой принадлежности крови человека турбидиметрическим методом использовалась кювета объемом 2800 мкл прямоугольной формы с внутренней толщиной зазора 5 мм. Световой луч, прошедший через исследуемую взвесь, поступал на полихромную веб-камеру Logitect-Quick Cam, подключённую к ПК.  с помощью который кювета с раствором фотографировалась. Отметим, что при фотографировании биообъектов, все настройки веб-камеры были зафиксированы и не изменялись при проведении экспериментальных работ.

Сразу после приготовления каждая проба подвергалась воздействию стоячей ультразвуковой волны. Кювета с исследуемой смесью располагалась на пьезопреобразователе, волна ориентировалась в вертикальном направлении. Для возбуждения пьезокерамического преобразователя использовался генератор Г3-112/1 с усилителем, а его выходное напряжение контролировалось осциллографом С1-79 (не показан на рис. 1). Генератор настраивался резонансно по отношению к преобразователю ν=2,25 МГц, а его выходное напряжение, подаваемое на пьезокерамику, не превышало 15 В, что обеспечивало ультразвуковое действие на эритроциты без их гемолиза.

Предварительные эксперименты [18, 19] позволили  подобрать оптимальное время действия ультразвука на смесь «стандартная сыворотка-исследуемые эритроциты-физиологический раствор» - 60 с. Это же время использовалось и для смеси «исследуемая плазма-стандартные эритроциты-физиологический раствор». Седиментация агглютинатов после выключения ультразвука продолжалась в течение 90 сек. (время инкубации образца), после чего надосадочная жидкость или отбиралась для дальнейших спектральных исследований, или же, образцы фотографировались с помощью веб-камеры. 

При компьютерной обработке видеоизображений седиментации агглютинатов осуществлялось разложение каждой полученной фотографии на RGB компоненты, а статистическому анализу подвергалась лишь G составляющая. Для 8-разрядной цифровой камеры кодирование состояния одного пикселя с помощью одного байта позволяет передавать 256 различных оттенков, например, серого цвета от полностью черного (B=0 ед. яркости) до полностью белого (B=255 ед. яркости). На рис. 3 показаны области, по которым производилось усреднение величин яркости изображений. Полученные средние значения яркости по заданной области пересчитывались в мощность светового потока, падающего на фотокамеру. Для этого использовалась экспериментально полученная калибровочная кривая – кривая соответствия мощности светового потока P, падающего на CCD камеру, величине яркости пикселя B (вопросы калибровки устройств цифровой микроскопии рассматривались, например, в [20]).

Значение разрешения R вычислялось следующим способом. По достаточно большому числу результатов измерений условия проведения которых заведомо предполагают, что реакция агглютинации будет отрицательной, вычисляется среднее значение мощности светового потока для отрицательной реакции Pср- и затем для всех измерений значение разрешения находится по формуле R = P/Pср-.

Хотя, как показали результаты спектральных исследований, цветность сывороток оказывает большее влияние на уровень сигнала для положительной реакции агглютинации, очевидно, что в случае применения данного подхода к вычислению разрешения, его величина определяется главным образом стоящим в знаменателе формулы значением уровня сигнала при отрицательной реакции агглютинации. Так как значение этой величины в условиях данного эксперимента близко к нулю, даже незначительные изменения ее значения могут привести к значительным изменениям значения разрешения R. Как показали результаты предварительных экспериментов, цветность сыворотки значительно влияет на величину разрешения метода.

Во избежание зависимости разрешения R от окраски сывороток световой зондирующий поток в экспериментах пропускался через нейтральный светофильтр (НС), причем каждому типу сыворотки соответствовал определенный светофильтр с соответствующим коэффициентом пропускания T. Это позволяло скомпенсировать влияние цветности сывороток на поглощение исследуемой взвеси эритроцитов и агглютинатов, и добиться того, чтобы величина падающего на веб-камеру светового потока была приблизительно одинаковой для всех четырех сывороток. Как было сказано выше, значение разрешающей способности R определяется в основном уровнем сигнала при отрицательной реакции агглютинации. Поэтому в ходе предварительных экспериментов осуществлялся поиск НС с подходящими значениями коэффициента пропускания с целью выровнять уровни попадающего на детектор сигнала при отрицательной реакции агглютинации для всех используемых сывороток. Одновременно определялось оптимальное  соотношение компонент взвеси «стандартная сыворотка/исследуемые эритроциты/физиологический раствор». Для этих экспериментов, чтобы исключить возможное влияние различного уровня гемоглобина в эритроцитах, значение которого может значительно меняться для разных проб, использовались эритроциты I группы крови, которая дает со всеми сыворотками отрицательную реакцию агглютинации, принадлежащие одному донору.

Объемная концентрация агглютинирующей сыворотки (Cсыв) оставалась неизменной для всей серии опытов и составляла, как и во всех прочих экспериментах 17,8%. Отношение концентраций «эритроцитарная масса/стандартная сыворотка» варьировалось от 1:5, (на одну часть эритроцитарной массы приходилось 5 частей стандартной сыворотки) до 1:85. Таким образом, объемная доля эритроцитарной массы варьировалась в пределах 0,2-3,6 %.

3. Экспериментальные результаты, обсуждение

На рис. 3 приведены спектры поглощения стандартных гемагглютинирующий сывороток. Видно, что оптическая плотность сывороток III и IV групп крови имеет ярко выраженную зависимость от длины волны оптического излучения видимого диапазона, причем в спектрах обеих сывороток присутствуют полосы поглощения, в диапазоне длин волн, соответствующем поглощению гемоглобина. В то же время для сывороток I и II групп крови зависимость оптической плотности и соответствующие полосы поглощения отсутствуют. Максимум мощности потока излучения светодиода типа LXHL-G1S приходится на длине волны λ = 540 нм, что также совпадает с одним из максимумов поглощения света гемоглобином в зеленой области спектра. Очевидно, что в этой спектральной области влияние окрашенности сывороток особенно велико.

На рис. 4 и 5 приведены спектры поглощения исследуемых взвесей для положительной и отрицательной реакций агглютинации эритроцитов соответственно. Видно, что окрашенность сывороток вносит существенные искажения в результаты измерений турбидиметрии на длине волны  λ = 540 нм. Особенно значительно влияние цветности сывороток при положительной реакции агглютинации, когда в силу седиментации агглютинатов исследуемая среда значительно просветляется и вклад рассеяния и поглощения света эритроцитами оказывается соизмеримым с поглощением света некоторыми окрашенными сыворотками. Естественно, это влияет на величину разрешающей способности акусто-оптического метода, изменяет соотношения между величинами разрешения метода для сывороток разных типов.

На рис. 6 приведены результаты экспериментов по подбору оптимального соотношения концентраций компонент взвеси «стандартная сыворотка/исследуемые эритроциты/физиологический раствор», а также оптимального значения коэффициента пропускания Т нейтрального светофильтра. В случае, когда корректировка падающего светового потока не производилось, во всех случаях использовался один и тот же НС с коэффициентом пропускания T = 31,8% (Рис. 6(а)). Во втором случае корректировка падающего светового потока  производилась согласно цветности сывороток: для сыворотки I и II групп использовался нейтральный светофильтр с коэффициентом пропускания 31,8 %, для сыворотки III группы - нейтральный светофильтр с коэффициентом пропускания 65,4 % (Рис. 6(б)). Видно, что корректировка потока зондирующего излучения с помощью НС приводит к тому, что значения мощности регистрируемого сигнала для сыворотки III группы крови заметно приближается к соответствующим значениям для сывороток I и II групп крови. Таким образом, корректировка с помощью подобранных НС позволяет выровнять световые потоки, падающие на веб-камеру в случае отрицательной реакции, и значительно уменьшить влияние цветности сывороток на разрешающую способность акусто-оптического метода. Выравнивание уровня падающего на веб-камеру светового потока важно именно для отрицательной реакции, так как при вычислении разрешения метода R=P+/P- значение P- находится в знаменателе дроби, и даже малые  изменения этой величины могут привести к значительным изменениям разрешающей способности акусто-оптического метода. 

В таблице 1 приводятся результаты сравнения значения разрешения R турбидиметрического метода без корректировки и с корректировкой интенсивности падающего светового потока при помощи соответствующих нейтральных светофильтров. Для определения значения разрешения метода в обоих случаях сначала вычислялось среднее значение мощности регистрируемого светового потока P- для всех реакций, которые принципиально соответствуют условиям для отрицательных реакций агглютинации, а затем значение разрешения для всех проведенных реакций вычислялось по формуле R = P/Pср-. Видно, что применение корректировки падающего на кювету светового потока при помощи предварительно подобранных НС и соответствующий подбор разбавления эритроцитов приводит к тому, что значение разрешения значительно возрастает, и, в то же время, стабилизируется. Это приводит к повышению надежности определения группы крови акусто-оптическим методом.

4. Заключение

Показано, что корректировка светового потока с помощью светофильтров индивидуально для различных типов сывороток существенно повышает разрешение акусто-оптического метода, как для прямого, так и обратного подходов перекрестного метода типирования крови, делает его более стабильными.  Это снижает возможность неправильной интерпретации результатов измерений при реальном типировании крови. Следует отметить, что повышение разрешения акусто-оптического метода и использование двух подходов перекрестного биомедицинского метода типирования крови особенно важно в случаях слабой агглютинации эритроцитов, когда возможна ошибка в определении групповой принадлежности крови. Данное исследование может быть использовано при разработке прибора для инструментального определения групповой принадлежности крови человека.

Литература

  1. Vyas G.N. et al. (San Francisco, CA), Simultaneous human ABO and RH(D) blood typing or antibody screening by flow cytometry, United States Patent 5,776,711 July 7, 1998.
  2. Sturgeon P. Immunohematology, 17, 4 (2001)
  3. Kline T.R., Runyon M.K., Pothiawala M., Ismagilov R.F. Anal Chem., 80(16) 6190-7 (2008)
  4. Muranyi I. et al. (Budapest, HU), Blood typing apparatus,United States Patent 4533638, US Patent Issued on August 6, 1985
  5. Steven R.A. A Simplified Visible/Near-Infrared Spectrophotometric Approach to Blood Typing for Automated Transfusion Safety, a thesis presented to North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA, (2005).
  6. Lambert J.B. A miniaturized device for blood typing using a simplified spectrophotometric approach, a thesis submitted to North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA, (2006).
  7. Moncharmont P., Plantier A., Chirat V., Rigal D. Immunohematology, 19(2), 54-6 (2003).
  8. Goldfinger Dennis, et al. (Encino, CA), Portable blood typing apparatus and method. United States Patent 4650662, US Patent Issued on March 17, 1987
  9. Battrell, C.F. et al., Microfluidic apparatus and methods for performing blood typing and crossmatching. United States Patent, Patent application number: 20100112723, Publication date: 05/06/2010
  10. Алипов А.Н., Ванинский В.З., Денисов Л.Б., Донсков С.И., Дубровский В.А., Завьялов Э.Н., Князьков Н.Н. Способ определения реакции агглютинации Авторское свидетельство изобретения. №1683760, приоритет от 04.06.1987, опубликовано Бюл. №38 от 30.10.1991. 
  11. Doubrovski V.A., Dvoretski K.N. Ultrasound in Medicine & Biology., 26(4), 655 (2000).
  12. Дубровский В.А., Дворецкий К.Н., Балаев А.Э. Акустический журнал, 50(2), 184 (2004).
  13.  Yu. A. Ganilova, V.A. Doubrovski, I. V. Zabenkov, The resolving power of the flowing method to register the process of human erythrocytes agglutination in vitro on the base of correlation analysis of microphotographs.  // Proc.SPIE. 2011 V7999. 799903
  14.  Дубровский В.А., Ганилова Ю.А., Забенков И.В., Применение спектрально фильтрованного зондирующего светового луча и RGB разложения микрофотографий для проточной регистрации агглютинации эритроцитов, усиленной ультразвуком,  Оптика и спектроскопия, 2012,  принята в печать.
  15. Дубровский В. А. , Долмашкин А. А. , Опт. и спектр., 109(2), 1346-50 (2010).
  16. Дубровский В.А., Долмашкин А.А., Определение группы крови на основе цифровых фотографий эритроцитов и их агглютинатов, Медицинская техника, 2012, №2, стр. 24-30.
  17.  Долмашкин А.А., Дубровский В.А., Забенков И.В., Определение группы крови на основе регистрации упругого рассеяния лазерного излучения методом цифровой фотографии, Квантовая электроника, 2012, 42, №5, 409-417.
  18.    Дубровский В.А., Медведева М.Ф., Оптимизация условий прямой и обратной реакций агглютинации эритроцитов, усиленных стоячей ультразвуковой волной, Бюллетень медицинских Интернет конференций (ISSN 2224‐6150), 2013. Том 3. № 3, стр. 651-656 ,  www.medconfer.com
  19. Дубровский В.А., М.Ф.Медведева М.Ф., Оптимизация условий прямой и обратной реакций агглютинации эритроцитов, усиленных стоячей ультразвуковой волной, Проблемы оптической физики и биофотоники. SFM-2013. Саратов : Изд - во «Новый ветер», 2013, стр. 34-42
  20. Ганилова Ю. А., Долмашкин А. А., Дубровский В. А., Янина И. Ю., Тучин В. В., Опт. и спектр.,115( 2),  68–74 (2013).

Таблицы

Таблица 1. Сравнение значения разрешения турбидиметрического метода без корректировки и с корректировкой интенсивности зондирующего светового потока для случая прямой компоненты перекрестного метода.

Группа крови

0(I)

A(II)

B(III)

AB(IV)

Сыворотка

Без корр.

С корр.

Без корр.

С корр.

Без корр.

С корр.

Без корр.

С корр.

0(I)

0,16

1,01

108,46

178,59

35,79

79,98

248,88

169,51

A(II)

1,81

0,97

0,90

1,27

12,37

210,78

10,19

111,43

B(III)

0,37

1,70

64,16

124,17

0,50

0,61

16,46

195,69

AB(IV)

1,81

1,11

0,61

0,74

1,81

0,81

1,02

0,79

Рисунки

Рис. 1. а) - Схема установки для регистрации реакции агглютинации эритроцитов; б) - Спектры: 1 – поглощение гемоглобина (левая ось ординат), 2 – излучение светодиода (правая ось ординат); в, г) - Типичные фотографии засветки кюветы с исследуемым раствором в зеленом канале RGB для: в) отрицательной и г) положительной реакций агглютинации. Прямоугольником выделены зоны статистической обработки экспериментальных результатов.
<p> Рис. 2. Спектры поглощения а) - стандартных гемагглютинирующих сывороток; б) - исследуемых взвесей при положительных реакциях агглютинации эритроцитов IV группы крови, в) - исследуемых взвесей при отрицательных реакциях агглютинации эритроцитов I группы крови с соответствующими гемагглютинирующими сыворотками. 1, 2, 3, 4 - сыворотки I, II, III и IV групп крови соответственно; 5 - спектр опорного сигнала (эритроциты в физиологическом растворе).</p>
<p> Рис 3.Зависимость мощности регистрируемого светового потока P от объемной доли стандартных эритроцитов для отрицательной реакции агглютинации эритроцитов I группы с сывороткой I группы (1), II группы (2), III группы (3). а) - Корректировка падающего светового потока не производилась; б) - производилась корректировка падающего светового потока согласно цветности сывороток.</p>
0
Ваша оценка: Нет



Яндекс.Метрика