нет
Введение. Рак мочевого пузыря (РМП) является самым частым онкологическим заболеванием мочевыделительной системы. В 2011 году в Российской Федерации диагностировано 13784 случая РМП, при этом прирост этого заболевания за последние 10 лет составил 15,26%. Летальность от РМП на первом году с момента установления диагноза составляет 19,5%. [1,2], поэтому диагностика и лечение больных раком мочевого пузыря (РМП) является одной из актуальных проблем урологии.
По клиническому течению выделяют мышечнонеинвазивный (Tis, Ta, T1), мышечноинвазивный (T2-T4) и метастатический РМП. Поверхностные и мышечноинвазивные опухоли мочевого пузыря в 90-95% представлены уротелиальной карциномой, но отличаются по целому ряду молекулярно-генетических, морфологических и иммуно-гистохимических признаков.
Мышечноинвазивный рак мочевого пузыря (МИРМП) - потенциально смертельное заболевание, так как без лечения больные погибают в течение 24 месяцев. У 50% больных МИРМП, оперированных радикально, развивается рецидив, что связано с морфологической стадией развития первичной опухоли и состоянием регионарных лимфатических узлов. Наиболее распространенная локализация метастазов уротелиального рака - регионарные лимфатические узлы (78%), печень (38%), легкие(36%), кости (27%), надпочечники (21%) и кишечник (13%), реже (1%- 8%) развиваются метастазы в сердце, головном мозге, почках, селезенке, поджелудочной железе, мозговых оболочках, матке, яичниках, простате и яичках[3,4,5]. Следует отметить, что в течение первого года развития заболевания группу МИРМП пополнят еще 15-30% больных с поверхностным РМП, у которых возникает рецидив опухоли с мышечной инвазией [6].
В России в 2011 году среди зарегистрированных впервые выявленных больных в 45,8% случаев диагностируются I - II, в 37,6% –III и в 16,6% –IV стадии РМП. В большинстве случаев органосохраняющее лечение удается провести только в Т1-Т2 стадиях заболевания. В Т3-Т4 стадиях выполняется цистэктомия или паллиативное лечение. Правильно выбранная тактика лечения является принципиальным моментом для дальнейшей жизни больного. Так, после удаления мочевого пузыря качество жизни больных значительно снижается, и им устанавливается 1 - 2 группы инвалидности. В то же время неоправданно длительное консервативное лечение может привести к гибели больных [7].
Сегодня изучено влияние на течение РМП более 30 прогностических факторов и установлено, что независимыми факторами, влияющими на общую выживаемость, являются только стадия опухоли и поражение метастазами регионарных лимфатических узлов (EAU-2009).
Результаты лечения РМП непосредственно связаны со стадией заболевания. Так, пятилетняя выживаемость в Т1 стадии составляет 90-80%, в Т2 – 70-63%, в Т3 – 53-32% и в Т4 – 28-5% [8]. Вместе с тем частота ошибок в предоперационном периоде при определении стадии рака мочевого пузыря достигает 73% [9]. Даже морфологическое исследование может давать ошибку в определении глубины инвазии опухоли в 20-50% [10].
Дооперационная диагностика метастазов в регионарных лимфатических узлах является неудовлетворительной. Компьютерная томография позволяет выявить только 35-40% метастатически пораженных лимфатических узлов, а тонкоигольная аспирационная биопсия лишь незначительно улучшает диагностику, так как ее чувствительность не превышает 60%, а выполняется эта процедура лишь при увеличенных лимфоузлах [11].
Поражение регионарных лимфатических узлов при инвазивном раке мочевого пузыря является крайне неблагоприятным прогностическим фактором. Показано, что после цистэктомии 50% больных умирают в течение 12 месяцев с регионарными метастазами в лимфатические узлы и 87% в течение 24 месяцев; пятилетняя выживаемость составляет менее 7%. Расширенная лимфодиссекция и системная химиотерапия достоверно улучшает выживаемость этих больных, поэтому дооперационная диагностика метастазирования в лимфоузлы может существенно повлиять на выбор тактики лечения в этой группе больных [12].
Кроме глубины инвазии опухоли и метастатического поражения лимфатических узлов, на прогноз МИРМП влияет степень злокачественности переходно-клеточной карциномы. Однако при мышечно-инвазивном РМП, как правило, не встречаются уротелиальные опухоли с низким злокачественным потенциалом или высокодифференцированные (G1) карциномы. Во всех случаях определяется уретериальный рак высокой степени злокачественности (G2 или G3 по классификации ВОЗ, 1973). В связи с этим дальнейшая дифференциация МИРМП не несет никакой прогностической информации [13].
Ошибки в стадировании заболевания на основании клинических и рутинных гистологических исследований стимулировали интерес к иммуногистохимии, позволяющей прогнозировать характер течения болезни у каждого конкретного больного на основании изучения молекулярных маркеров. Наиболее изученными генами, вовлеченными в регуляцию клеточного цикла, являются гены-супрессоры опухоли p53 и p21. Ген р53 регулирует клеточный цикл и апоптоз, контролирует целостность генома. Активируясь в ответ на самые разные неблагоприятные воздействия, p53 осуществляет на транскрипционном уровне одновременно и активацию гена bax, и супрессию гена bcl-2, отвечающих за апоптоз. При развитии неоплазий, в том числе и переходно-клеточных карцином, часто отмечаются соматические мутации гена р53. Мутации Р53 при карциномах уротелия выявляют в 29-53% случаях, однако мнения авторов о прогностической ценности этого показателя противоречивы [14].
Пролиферативная активность клетки может быть оценена при помощи различных методик. К ним относятся подсчет количества митозов Ki-67-позитивных клеток, выявление антигена ядра пролиферирующей клетки (PCNA), Р63. Антитела к Ki-67 применяют для оценки пролиферативной активности многих новообразований. Его прогностическая ценность доказана при поверхностном раке мочевого пузыря[15]. Исследование Ki-67 позволяет прогнозировать темп роста опухоли и реакцию опухоли на проводимую химиотерапию. Ki-67 так же является независимым прогностическим фактором в отношении рецидивирования у больных с поверхностными формами РМП, имеющих высокий риск [6]. Сведения о влиянии Ki-67 на прогноз у больных с МИРМП противоречивые и изучены недостаточно.
Цель исследования: провести сравнительную оценку эффективности различных иммуногистохимических маркеров в определении стадии и прогнозе мышечно-инвазивного РМП.
Материалом для исследования послужил операционный материал 80 пациентов с новообразованиями мочевого пузыря, проходивших лечение в НИИ клинической и фундаментальной уронефрологии СГМУ и группе контроля (таб.1).
Операционный и биопсийный материалы были фиксированы в 10% –ном растворе нейтрального формалина и залиты в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм, окрашенные гематоксилином и эозином, были подвергнуты обзорному морфологическому анализу, при котором стадию рака определяли в соответствии с классификацией TNM, а степень дифференцировки опухолевых клеток оценивали в соответствии с рекомендациями ВОЗ, 2004. Изучение препаратов было проведено с применением бинокулярного микроскопа «Micros MC100» при 600-кратном увеличении (объектив - 40х, бинокулярная насадка - 1,5х, окуляры - 10х). Материал был разделен по группам с учетом клинической стадии рака. Всего было исследовано 94 образца.
Исследовано 3120 срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, и на 12 различных маркеров.
Для иммуногистохимического исследования были использованы 12 коммерческих моноклональных антител, разделенных на группы по функциональной значимости:
Методика иммуногистохимического окрашивания
Иммуногистохимические реакции ставили на серийных парафиновых срезах (5мкм), используя стрептавидин-биотиновый метод. В качестве детекционной системы применяли систему LSAB2 System, HRP (K0675), Dako, в качестве хромогена – диаминобензидин (Dako).
Интенсивность реакций, локализованных в цитоплазме (цитокератины 7,8,13, 17,18,19) и на мембранах клеток (EGFR) оценивали полуколичественным способом по балльной шкале от 0 до 3 с помощью светового бинокулярного микроскопа «MicrosMC100», учитывая выраженность реакции и ее локализацию: 0 – отсутствие реакции, 1 – слабая реакция, 2 – умеренная реакция, 3 – сильная реакция.
Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию (PCNA, Ki67, p53, p63, bcl2), оценивали, подсчитывая количество окрашенных ядер на 100 ядер в 3 полях зрения, выражая полученные результаты в процентах.
Результаты реакций с антигенами, имеющими ядерную локализацию (PCNA, Ki67, p53, p63, bcl2) оценивали по системе подсчета histochemicalscore . Система подсчета включает в себя интенсивность иммуногистохимической окраски по 3-х бальной шкале и долю (%) окрашенных клеток и представляет собой сумму произведений процентов, отражающих долю клеток с различной интенсивностью окраски на балл, соответствующий интенсивности реакции. Интенсивность окраски 0 – нет окрашивания, 1 – слабое окрашивание, 2- умеренное окрашивание, 3 – сильное окрашивание.
Формула подсчета следующая: histochemicalscore = ∑ P (i) х i,
где i - интенсивнось окрашивания, выраженная в баллах от 0 до 3. P (i) – процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью. Максимальное значение гистосчета должно соответствовать 300.
Статистический анализ проводили с использованием пакета программ статистической обработки результатов SSPS 13.0 forWindows.
Результаты. При иммуногистохимическом исследовании 12 онкомаркеров было установлено, что для установления стадии рака мочевого пузыря и прогноза заболевания рационально использовать только 4: маркеры пролиферативной активности Ki67, p63, супрессор опухолевого роста – р53 и рецептор эпидермального фактора роста — EGFR. В таблице 2 дана сравнительная оценка эффективности иммуногистохимических маркеров для определения стадии РМП.
Из таблицы 2 видно, что все эти маркеры не дают положительной экспрессии в группе сравнения, что может использоваться при дифференциальной диагностике
РМП и других неоплазий. Кроме этого, процент экспрессирующих клеток указанных маркеров позволяет судить о степени инвазии РМП, что является важным моментов для определения стадии заболевания, следовательно, и прогноза. Именно поэтому Ki 67 весьма перспективно можно использовать для дифференциальной диагностики между Т2 и Т3-Т4, что является весьма важным, так как выход опухоли за пределы органа свидетельствует о неблагоприятном прогнозе. Он может быть использован, как прогностический, способный повлиять на выбор тактики лечения у больных МИРМП.
При анализе показателей экспрессии маркеров в каждой из стадий РМП, представленной в таблице 3, установлено, что маркер Ki 67 показал 100% -ную экспрессию у пациентов со стадией РМП Т3 и Т4, в то время как в стадии Т2 его экспрессия составила только 56,5%, что является достоверным различием.
С целью изучения прогностической значимости были изучены отдаленные результаты лечения 27 больных РМП, чью судьбу удалось проследить на протяжении 5 лет. У всех пациентов при иммуногистохимическом исследовании ткани опухоли Ki 67 дал положительную экспрессию.
Из 27 больных РМП 11 пациентам выполнено органосохраняющее, комплексное лечение, включающее в себя трансуретральную электрорезекцию стенки мочевого пузыря вместе с опухолью и системную полихимиотерапию по схеме M-VAC (метотрексат, винбластин, доксорубицин, цисплатин). У 13 больных произведена цистэктомия, а 6 пациентов признаны иноперабельными; им осуществляли только симтоматическую терапию.
Из таблицы 4 видно, что из 27 больных РМП – 16(59,2%) умерло. Из них 10 (62,5%) – в первый год. Из 10 умерших в первый год 9 (90%) пациентов имели экспрессию Ki 67 ≥ 30%. У всех 9 больных стадия заболевания была Тзb-T4N0-1M0-1.
В то же время из 11 больных РМП, которые прожили более 5 лет, в 70% экспрессия Ki 67 составила < 30%. Стадия заболевания у выживших больных, была Т1N0M0- 4; Т2N0M0- 6; Т3N0M0-1.
Таким образом, независимо от способа лечения с достоверностью в 81,2% Ki67 может предсказать неблагоприятный исход заболевания в течение 24 месяцев.
При мышечноинвазивном РМП Т2N0M0-Т3-4N0-1M0-1 (22 больных) в первые 24 месяца умерли 14(62%). Экспрессия Ki 67у этих больных колебалась от 30 до 80%.
При органосохраняющем лечении больных в стадии Т1-Т2 (11 пациентов) в первые два года умерло 5(45,4%) больных, у которых экспрессия Ki 67 составляла ≥30%.После цистэктомии (n=13) умерли 8(61,5%), у 7(87,5%) из них Kj 67 был >30%. Из 11, проживших 5лет и более лет только в двух случаях Kj 67 было >30% (34 и 44), у остальных – 9 (82%) Ki67 был менее 30%.
Заключение. Проведенная сравнительная оценка эффективности различных иммуногистохимических маркеров в стадировании и прогнозе мышечно-инвазивного РМП показала, что наиболее эффективным маркером является маркер пролиферативной активности – Ki 67. Установлено, что при экспрессии
Ki 67 >30%, независимо от способа лечения, с достоверностью в 81, 2% возможны рецидив заболевания и летальный исход в течение 24 месяцев. В то же время при значениях Ki67 < 30% пятилетняя выживаемость составляет 70%.
Таким образом, маркер пролиферативной активности – Ki 67 может быть вспомогательным прогностическим фактором при выборе объема оперативного лечения (органосохраняющая операция или цистэктомия).
Таблица 1.Характеристика исследуемых больных
Показатель |
Количество больных |
|
Абс. |
% |
|
Общее число РМП |
80 |
100 |
Средний возраст, годы |
63+-0,5 |
|
Мужчин |
68 |
85 |
Женщин |
12 |
15 |
Стадия заболевания |
||
Т0N0M0 –группа сравнения |
14 |
17,5 |
ТаN0M0 |
15 |
18,7 |
Т1N0M0 |
9 |
11,2 |
T2N0M0 |
23 |
28,7 |
T3аN0M0 |
6 |
7,5 |
T3bN1M0 |
2 |
2,5 |
T4aN0M0 |
7 |
7,5 |
T4a-bN1M0 |
2 |
2,5 |
T4a-bN1M1 |
2 |
2,5 |
Гистологический диагноз |
||
Переходно-клеточный рак |
66 |
82,5 |
Цистит |
14 |
17,5 |
Гистологическая степень злокачественности у 66 больных РМП |
||
G- 1 |
24 |
36,3 |
G- 2 |
22 |
33,3 |
G- 3 |
20 |
30,4 |
Таблица 2. Сравнительная оценка эффективности иммуногистохимических маркеров при мышечно-неинвазивном и мышечноинвазивном РМП
Исследуемые группы |
Иммуногистохимические маркеры |
|||
Р53 |
Ki-67 |
Р 63 |
EGFR |
|
Группа сравнения ТоNоMо, n=14 |
0 |
0 |
0 |
0 |
МНРМП Та-1NоMо, n=24 |
3 12,5% |
12 50% |
7 29% |
1 (4,1%) |
МИРМП Т2-4N0-1M0-1, n=42 |
19 45,2% |
32 76,1% |
23 54,7% |
7 16,6% |
Таблица 3.Показатели экспрессии иммуногистохимических маркеров РМП у больных в зависимости от стадии заболевания
Маркер Стадия |
Количество больных в группе |
Положительный результат |
||||
р53 |
Ki-67 |
PCNA |
р63 |
EGFR |
||
T0N0M0 |
14 |
0 |
0 |
9 (64,2%) |
0 |
0 |
TaN0M0 |
15 |
13% |
46,6% |
13% |
13% |
0 |
T1N0M0 |
9 |
11% |
55,5% |
11% |
55% |
11,1% |
T2N0M0 |
23 |
43% |
56,5% |
43% |
52% |
8,6% |
T3N0-1M0 |
8 |
50% |
100% |
50% |
75% |
25% |
T4N0-1M0-1 |
11 |
45% |
100% |
45% |
45,4% |
27,2% |
Всего больных РМП |
66 |
22 |
44 |
31 |
30 |
8 |
Таблица 4.Методы лечения у больных РМП с положительной экспрессией Ki 67
Значения Ki 67 |
Кол-во больных |
Метод лечения |
Выживаемость |
|||
Резекция МП, ТУР+Х.Т. |
Цист-эктомия |
Паллиа-тивное лечение |
Умерли в течение 2-х лет |
Живы 5 лет и более |
||
Ki 67 ≤ 30% (ср.14,1%) |
11 (40,7%) |
5 (45,4%) |
6 (54,6%) |
- |
3 (27,2%) |
8 (72,8%) |
Ki 67 ≥ 30% (ср.48,6%) |
16 (59,3%) |
6 (37,5%) |
7 (43,7%) |
3(18,7%) |
13 (81,2%) |
3 (18,8%) |
Всего |
27 (100%) |
11 (40,7%) |
13 (48,1%) |
3 (11,1%) |
16 (59,2%) |
11 (40,8%) |