Перепончатокрылые (Hymenoptera) – один из наиболее многочисленных, таксономически сложных и практически важных отрядов насекомых, насчитывающий более 150 тысяч описанных видов (Heraty et al., 2011; Aguiar et al., 2013). Основные группы данного отряда представлены сидячебрюхими (Symphyta), жалящими (Aculeata) и паразитическими перепончатокрылыми, или наездниками (Parasitica) (Gauld, Bolton, 1988). Представители этих групп весьма разнообразны по своей биологии, являясь фитофагами, паразитоидами, хищниками, а также опылителями растений и нектарофагами (Расницын, 1980). В мире, вероятно, насчитывается около миллиона видов паразитических Hymenoptera (Quicke, 1997). Многие наездники имеют существенное экономическое значение, поскольку они паразитируют на различных насекомых и других членистоногих, включая важнейших вредителей сельского и лесного хозяйства (Godfray, 1994). К настоящему времени изучены хромосомные наборы около 500 видов паразитических перепончатокрылых (Gokhman, 2009; Гохман, 2015б), что, таким образом, составляет всего порядка 0.05% от их возможного числа в мировой фауне. Тем не менее, в последние годы опубликован ряд важных исследований, позволяющих существенно продвинуться в области изучения хромосом наездников (Гохман, 2015б). Показательно, что эти работы включают результаты исследования кариотипов как с помощью обычной окраски, так и с применением более продвинутых методов хромосомного анализа. Здесь важно понимать, что такой анализ может осуществляться с различными целями, что, в свою очередь, определяет совокупность специфических подходов и методов, а также результатов, получаемых в ходе этого исследования. В частности, информация о числе хромосом и других аналогичных особенностях структуры кариотипа востребована прежде всего (хотя и не только) систематикой наездников, тогда как сведения, полученные с помощью современных методов, в основном могут быть использованы в генетических исследованиях данной группы (Гохман, 2015б).

Основные особенности структуры и эволюции кариотипа наездников

Для большинства перепончатокрылых (в том числе паразитических) характерен арренотокический партеногенез, при котором самки обычно развиваются из оплодотворенных (диплоидных) яиц, а самцы – из неоплодотворенных, т.е. гаплоидных, хотя из этого правила имеется целый ряд исключений (Crozier, 1975). Хромосомы паразитических Hymenoptera сравнительно крупны (длиной в среднем 3-5 мкм) и являются моноцентрическими, т.е. каждая из них несет единственную центромеру. Гаплоидное число хромосом (n) у наездников может варьировать от 3 до 23 (Gokhman, 2009). Распределение паразитических перепончатокрылых по числу хромосом на видовом уровне является отчетливо бимодальным с двумя максимумами при n = 6 и 11. Первый из них характерен прежде всего для надсемейства Chalcidoidea, а второй – для большинства других групп, в том числе для Ichneumonoidea. Что же касается основных черт эволюции кариотипа, то исходным для наездников, очевидно, следует считать хромосомный набор с относительно высоким значением n (14-17) и преобладанием двуплечих хромосом (Gokhman, 2009). В различных филогенетических линиях паразитических Hymenoptera происходило независимое и неоднократное уменьшение хромосомных чисел. В целом в эволюции наездников доминировали два основных процесса: редукция числа хромосом и диссимметризация кариотипа за счет увеличения размерной дифференциации его элементов, а также повышения пропорции субтелоцентрических и акроцентрических хромосом в наборе (Gokhman, 2009). Разумеется, в тех или иных филогенетических ветвях имели место и обратные процессы, т.е. возрастание хромосомных чисел и увеличение доли мета- и субметацентриков в составе кариотипов, однако подобные явления были существенно ограничены по своим масштабам.

Хорошо известно, что в хромосомных наборах живых организмов, наряду с A-хромосомами, являющимися постоянными элементами нормального кариотипа, могут быть представлены и т.н. B-хромосомы, факультативно присутствующие в наборе (Коряков, Жимулев, 2009). Наибольшее число хромосом подобного типа, известное для наездников, недавно обнаружено у одного из представителей хальцид семейства Eulophidae, Pnigaliogyamiensis Myartseva et Kurashev, с 2n = 12 + 0-6B (Gokhman et al., 2014b). До сих пор в диплоидных наборах паразитических перепончатокрылых было выявлено не более двух B-хромосом, как, например, у других наездников рода Pnigalio Schrank, P. agraules (Walker) и P. mediterraneus Ferrière et Delucchi (Gebiola et al., 2012; Gokhman et al., 2014b). Ранее пара аналогичных хромосом также была обнаружена в диплоидном кариотипе Aphidiuservi Haliday (Braconidae) (Gokhman, Westendorff, 2003).

Методы, применяемые в настоящее время для изучения хромосом паразитических перепончатокрылых, можно (разумеется, весьма условно) разделить на т.н. "традиционные" и "современные" (Гохман, 2015б). К первым относятся: обычная окраска хромосом, их морфометрический анализ, и, кроме того, "классические" методы дифференциальной окраски, т.е. C- и AgNOR-бэндинг. В свою очередь, к "новым" методам можно отнести окраску флуоресцентными красителями (флуорохромами), специфически связывающимися с областями ДНК, обогащенными АТ- или ГЦ-парами оснований, а также гибридизацию нуклеиновых кислот insitu (прежде всего флуоресцентную гибридизацию, или FISH) и методы иммуноцитогенетики, предусматривающие использование специфических антител, меченных флуорохромами.

Применение результатов хромосомного исследования в систематике наездников

В последние годы все более очевидными становятся возможности использования сведений о структуре кариотипа для систематики наездников, прежде всего для выявления и диагностики криптических видов (Gokhman, 2015). В частности, использование для этих целей хромосомных признаков, как и других данных, не зависящих от прямого влияния внешней среды, является весьма важным для систематики такой группы, как паразитические перепончатокрылые, у которых часто встречаются т.н. "расы по хозяину", или особые "линии" с неясным таксономическим статусом (Clarke, Walter, 1995). К настоящему времени опубликованы разнообразные свидетельства в пользу того, что многие "виды" наездников с широкой пищевой специализацией в действительности представляют собой комплексы трудноразличимых узкоспециализированных видов (см., например: Smith et al., 2008; Zhang et al., 2011; Derocles et al., 2016). Ныне инструментом изучения таких комплексов обычно служит молекулярно-генетическое исследование (Chesters et al., 2012; Kenyon et al., 2015), однако примеры использования анализа хромосомных наборов в подобных целях также могут быть весьма показательными. В частности, в ходе таксономической ревизии хальцид рода Anisopteromalus Ruschka из семейства Pteromalidae нам удалось обнаружить и описать в качестве нового для науки всесветно распространенный вид, A. quinarius Gokhman et Baur, с гаплоидным числом хромосом n = 5. Этот вид связан с жуками-точильщиками (Anobiidae), в основном обитающими в человеческом жилище (Baur et al., 2014). Данный наездник ранее отождествлялся с еще одним представителем рода Anisopteromalus, эффективным энтомофагом A. calandrae (Howard), который обычно паразитирует на других жесткокрылых, прежде всего на долгоносиках семейства Dryophthoridae, связанных с запасами зерна, и имеет n = 7. Детальное описание хромосомных наборов показало, что оба вида весьма существенно разнятся по структуре кариотипа, так что нам не удалось определить те или иные перестройки, за счет которых происходили преобразования хромосомных наборов (Gokhman et al., 1998). Тем не менее, указанные виды хорошо различаются как по качественным, так и по количественным особенностям морфологии (Baur et al., 2014). Наряду с этим, между A. quinarius и A. calandrae обнаружены существенные различия по молекулярно-генетическим признакам, а именно, по структуре последовательностей ДНК спейсера ITS2 и цитохрома b, т.е. как по ядерным, так и по митохондриальным генам. Более того, взаимное соответствие информации по данным последовательностям свидетельствует об отсутствии гибридизации между рассматриваемыми видами (как в настоящем, так и в обозримом прошлом).

Отдельного обсуждения заслуживает тот факт, что, несмотря на все различия между A. calandrae и A. quinarius, последний из этих видов вплоть до настоящего времени оставался незамеченным большинством специалистов-систематиков. Основные причины такой ситуации изложены в соответствующей статье (Baur et al., 2014). Прежде всего, данные виды довольно близки, и только тщательный анализ количественных и качественных морфологических признаков позволил выявить надежные различия между этими таксонами. Далее, различающиеся предпочтения A. calandrae и A. quinarius по отношению к хозяевам привели к тому, что лишь немногие исследователи могли одновременно получить и содержать живые культуры обоих видов, чтобы проверить их на репродуктивную изоляцию. Однако, даже если бы подобную изоляцию удалось обнаружить, ее скорее всего посчитали бы побочным результатом разнонаправленной адаптации наездников к различным видам-хозяевам. Более того, наблюдаемые морфологические различия между этими паразитоидами также можно было бы объяснить развитием наездников на тех или иных хозяевах (как с точки зрения предшествующего отбора в длинном ряду поколений, так и в терминах модификационной изменчивости). Наконец, обнаружение A. quinarius было существенно затруднено тем, что можно условно назвать "давлением таксономической традиции", поскольку почти все авторитетные специалисты-систематики (как и опубликованные ими работы) утверждали, что A. calandrae является единственным всесветно распространенным представителем рода Anisopteromalus (см., например: Bouček, Rasplus, 1991) и, таким образом, потребовались достаточно серьезные основания, чтобы поставить подобное мнение под вопрос.

Кроме этого, в ходе многолетних исследований вышеназванных видов удалось показать, что A. quinarius и A. calandrae обладают альтернативными стратегиями жизненного цикла, соответствующими аналогичным характеристикам предпочитаемых ими хозяев (Gokhman et al., 1999; Timokhov, Gokhman, 2003). Более того, представляется весьма вероятным, что такие разные по своей аутэкологии насекомые, как долгоносики и точильщики, имеют слишком различные жизненные стратегии, чтобы на них мог успешно развиваться один и тот же паразитоид-полифаг. Видимо, именно этими соображениями руководствовались наши зарубежные коллеги, когда предположили, что еще один всесветно распространенный наездник из семейства Pteromalidae со сходной биологией, Lariophagusdistinguendus (Förster), также представляет собой комплекс двух близких видов. Проверка показала, что данные паразитоиды отличаются друг от друга по некоторым молекулярно-генетическим признакам и экологическим особенностям (König et al., 2015). Наряду с этим, проведенное нами исследование продемонстрировало, что рассматриваемые виды различаются и по структуре кариотипа, включая число хромосом (n = 5 и 6). Морфометрический анализ хромосомных наборов позволил определить, что каждому из плеч наибольшего по длине метацентрика в составе кариотипа с n = 5 соответствуют два элемента в наборе с n = 6: более короткая метацентрическая хромосома, а также небольшой акроцентрик. Отсюда следует, что эти хромосомные наборы, очевидно, различаются по двум последовательным перестройкам – центрическому разделению и перицентрической инверсии (Gokhman, 2015), преобразовавшей одну из двух акроцентрических хромосом, образовавшихся в результате такого разделения, в новый, более короткий, метацентрик. Разумеется, теоретически возможна и обратная последовательность событий, т.е. сначала произошла перицентрическая инверсия, превратившая метацентрическую хромосому из кариотипа с n = 6 в акроцентрическую, а затем – центрическое слияние двух акроцентриков с образованием крупного метацентрика. Этой версии, однако, противоречат два обстоятельства. Прежде всего, у подавляющего большинства птеромалид отмечены гаплоидные наборы, состоящие из пяти двуплечих хромосом, так что n = 6, очевидно, является более продвинутым состоянием для соответствующего кариотипа, да и среди всех представителей семейства Pteromalidae акроцентрические хромосомы выявлены только в наборе указанного вида (Гохман, 2015б). Так или иначе, эти паразитоиды способны при определенных условиях давать гибридное потомство (König et al., 2015), и данная ситуация, следовательно, представляет собой первый известный случай успешной гибридизации двух видов наездников с различным числом хромосом.

Таким образом, в настоящее время среди специалистов по паразитическим перепончатокрылым растет понимание важности результатов хромосомных исследований для систематики этой группы (Гохман, 2015б). Прежде всего, данное обстоятельство связано с осознанием того факта, что таксономическая структура наездников на видовом уровне оказалась гораздо сложнее, чем было принято считать еще сравнительно недавно (Smith et al., 2008). Это, разумеется, в основном связано с информацией, полученной в ходе молекулярно-генетических исследований, однако, как продемонстрировано выше, данные хромосомного анализа также подтверждают указанную точку зрения. Более того, во многих группах видов паразитических Hymenoptera, очевидно, существует отчетливая корреляция между степенью морфологических и хромосомных различий, с одной стороны, и уровнем репродуктивной изоляции – с другой (см., например: Gokhman, 2015). Наконец, с учетом того обстоятельства, что признаки структуры кариотипа являются в широком смысле морфологическими (Gokhman, 2009), эти особенности подчас оказываются единственными особенностями морфологии, по которым можно разделить те или иные близкие виды (Gokhman, 2015).

Использование результатов хромосомного анализа наездников в филогенетических и эволюционных исследованиях

Филогенетический анализ хромосомных перестроек, обнаруженных у паразитических Hymenoptera, может оказаться достаточно эффективным. Например, исследование хромосомных наборов хальцид рода Aphelinus Dalman (Aphelinidae) показало (Gokhman et al., 2015), что исходным для этого рода, вероятно, является гаплоидный кариотип с пятью близкими по размерам метацентрическими хромосомами, характерный для менее продвинутых видовых комплексов daucicola(A. daucicola Kurdjumov) и mali(A. coreae Hopper et Woolley, A. glycinis Hopper et Woolley, A. rhamni Hopper et Woolley, а также A. mali (Haldeman)). В то же время у видов комплекса varipes, имеющих n = 4 (A. atriplicis Kurdjumov, A. certus Yasnosh и A. varipes (Förster)), обнаружен хромосомный набор с одним крупным метацентриком и еще одним – среднего размера, а также двумя более мелкими акроцентрическими хромосомами. Очевидно, в рассматриваемой группе произошло хромосомное слияние и несколько перицентрических инверсий. При этом, у двух других представителей данного комплекса, A. kurdjumovi Mercet и A. hordei Kurdjumov, являющихся сестринскими видами, вначале сохраняется более короткий метацентрик (A. hordei), хотя его центромера немного сдвигается в терминальном направлении, а затем данный элемент превращается в близкую по размерам акроцентрическую хромосому (A. kurdjumovi); в последнем случае, видимо, имели место последовательные перицентрические инверсии. Интересно, что размер генома представителей комплекса mali (определенный как цитофотометрически, так и по результатам полного секвенирования геномов) существенно выше, чем у двух других изученных нами групп рода Aphelinus, несмотря на сходство кариотипов данного комплекса с таковым daucicola и их отличие от хромосомных наборов группы varipes.

Вообще говоря, одновременное исследование кариотипов и размеров генома паразитических перепончатокрылых показывает, что рассматриваемые характеристики зачастую эволюционируют более или менее независимо друг от друга (см., например: Gokhman et al., 2011). В свою очередь, это связано как с возможностью существенного накопления/утраты повторяющихся последовательностей ДНК (как правило, в гетерохроматиновых районах) без заметных изменений структуры кариотипа (по крайней мере, числа хромосом), так и с тем, что многие хромосомные перестройки, известные для наездников (Gokhman, 2009), практически не отражаются на размерах генома, определяемых современными методами, вследствие весьма ограниченных изменений количества ядерной ДНК в подобных случаях.

В некоторых случаях удается не только идентифицировать те или иные преобразования хромосомных наборов, базируясь на существующих филогенетических реконструкциях, но и выделить синапоморфии по особенностям структуры кариотипа. Например, относительно низкие хромосомные числа некоторых представителей рода Eurytoma Illiger с n = 5-7, очевидно, представляют собой апоморфные состояния этого признака по сравнению с плезиоморфным n = 10, характерным для других видов данного таксона (Gokhman, Mikhailenko, 2008). Указанные представители Eurytoma – Eu. robusta Mayr, Eu. serratulae (Fabricius) и Eu. compressa (Fabricius) – принадлежат к двум группам видов, robusta и tibialis, и, таким образом, эти группы являются синапоморфными не менее, чем по трем хромосомным слияниям, а представители последней из них, Eu. compressa и Eu. serratulae с n = 5 и 6 соответственно, – по еще одной подобной перестройке.

Значение хромосомного исследования для решения вопросов генетики паразитических перепончатокрылых

Сведения о хромосомных числах наездников и других перепончатокрылых, наряду с их использованием в систематике, могут оказаться полезными и для генетиков, в частности, в рамках популярной ныне концепции больших массивов данных ("big data") (May, 2014). Например, нам в сотрудничестве с зарубежными коллегами удалось продемонстрировать существенно более высокий разброс уровней генетической рекомбинации у общественных (эусоциальных) перепончатокрылых по сравнению с одиночными (Ross et al., 2015). В качестве мерила такой рекомбинации были использованы имевшиеся в нашем распоряжении оригинальные и литературные данные о хромосомных числах более полутора тысяч видов перепончатокрылых. Указанные сведения были наложены на филогенетическое древо отряда Hymenoptera, построенное по результатам изучения девяти последовательностей ДНК этой группы, взятых из хорошо известного Интернет-депозитария под названием GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). В частности, скорость эволюции хромосомных чисел, т.е. межвидовая дисперсия по рассматриваемому показателю, у общественных перепончатокрылых оказалась примерно втрое выше, чем у одиночных.

Для цитогенетического исследования наездников, как и многих других организмов, также применяются "традиционные" методы дифференциальной окраски, а именно, C- и AgNOR-бэндинг, соответственно выявляющие на хромосомах конститутивный гетерохроматин и область ядрышкового организатора (Gokhman, 2009). В частности, с помощью C-окраски у Dirophanesinvisor (Thunberg) из семейства Ichneumonidae впервые для паразитических перепончатокрылых был обнаружен популяционный полиморфизм по гетерохроматиновым блокам (Гохман, 1997). Более того, в этой же работе показано, что близкие виды наездников с одинаковым числом хромосом (D. invisor и D. fulvitarsis (Wesmael) с 2n = 20) могут резко различаться по величине и локализации блоков конститутивного гетерохроматина. С другой стороны, число и расположение ядрышковых организаторов, т.е., с точки зрения молекулярной генетики, кластеров рибосомной ДНК (см. ниже), также достаточно лабильно, и может существенно различаться даже в пределах рода (см., например: Giorgini, Baldanza, 2004).

Что же касается современных методов хромосомного исследования паразитических Hymenoptera, то в последние годы их применение существенно возросло. Одним из таких методов, в частности, является окраска АТ- и ГЦ-специфичными флуорохромами (Gokhman, 2009). Примером первых могут служить такие красители, как DAPI или Hoechst 33258, а вторых – хромомицин А₃ (CMA₃). Поскольку хромосомная ДНК паразитических перепончатокрылых, как правило, обогащена АТ-парами, она почти полностью окрашивается соответствующими флуорохромами, за исключением области ядрышкового организатора, которая, в свою очередь, селективно окрашивается CMA₃ (Bolsheva et al., 2012).

Весьма важным методом изучения хромосом также является гибридизация insitu, подразумевающая использование меченных тем или иным способом последовательностей ДНК и позволяющая локализовать их на хромосомах. Например, именно с помощью этого метода была выполнена пионерская для своего времени работа, продемонстрировавшая локализацию генома симбиотического полиднавируса на одной из хромосом браконида Cotesiacongregata (Say) (Belle et al., 2002). Ныне, однако, в качестве меток для вышеуказанных последовательностей ДНК служат почти исключительно различные флуорохромы, в силу чего сама методика получила название флуоресцентной гибридизации insitu, или FISH. Объем исследований, выполненных с использованием данного метода, постоянно возрастает. Так, при помощи FISH нами впервые проведено сравнительное изучение локализации кластеров рДНК у представителей надсемейств Ichneumonoidea (семейство Ichneumonidae), Cynipoidea (Cynipidae) и Chalcidoidea (Eurytomidae и Torymidae) (Gokhman et al., 2014a). На основании собственных (Bolsheva et al., 2012; Gokhman et al., 2014a) и литературных данных (Belle et al., 2002; Van Vugt et al., 2005; Carabajal Paladino et al., 2013) было продемонстрировано, что количество кластеров рДНК в гаплоидных хромосомных наборах паразитических Hymenoptera варьирует от одного до шести. Данный показатель в целом коррелирует с числом хромосом, хотя исключения из этого правила встречаются довольно часто (например, в семействе Eurytomidae). В нашей недавней работе (Gokhman et al., 2014a) также впервые показано, что у вышеприведенных перепончатокрылых (и, очевидно, у наездников в целом) отсутствуют ДНК-повторы типа TTAGG, характерные для теломерных областей хромосом многих других насекомых, включая большинство жалящих Hymenoptera. Необходимо, однако, отметить, что отсутствие данных повторов было выявлено и у единственного изученного представителя надсемейства Vespoidea, Metapolybiadecorata (Gribodo) из семейства Vespidae (Menezes et al., 2013), и, таким образом, картина распределения вышеуказанных последовательностей в пределах отряда перепончатокрылых в настоящее время является существенно более сложной, чем это представлялось еще несколько лет назад (Mason et al., 2016). Кроме того, FISH в сочетании с техникой хромосомной микродиссекции позволяет опознавать отдельные хромосомы и их сегменты, получающие те или иные флуоресцентные метки. С использованием подобной методики, т.е. с помощью многоцветной FISH, или хромосомного пэйнтинга, пока изучен единственный вид перепончатокрылых, а именно наездник Nasoniavitripennis (Walker) из семейства Pteromalidae (Rütten et al., 2004).

Таким образом, FISH в настоящее время является важнейшим способом физического картирования последовательностей ДНК на хромосомах различных организмов (в том числе паразитических перепончатокрылых), что делает его весьма перспективным методом в связи с резким ростом объема исследований по секвенированию геномов (Gadau et al., 2015). Дополнительную важность этой методике придает тот факт, что повторяющиеся последовательности, обычно занимающие значительную часть генома эукариот, с большим трудом поддаются картированию при полногеномном секвенировании (см., например: Treangen, Salzberg, 2011), но успешно картируются с помощью FISH.

Наконец, все большее распространение в изучении хромосом наездников, очевидно, будут находить методы иммуноцитогенетики, позволяющие определять содержание и локализацию различных хромосомных компонентов. Например, в ходе нашего исследования (Bolsheva et al., 2012) впервые для перепончатокрылых изучено распределение интенсивности метилирования ДНК по длине хромосом Entedoncionobius Thomson и E. cioni Thomson (Eulophidae) с использованием антител к 5-метилцитозину. Как известно, метилирование оснований ДНК (прежде всего цитозина) существенно влияет на уровень работы различных генов (Glastad et al., 2011). Оказалось, что наиболее интенсивные метки выявляются в теломерных областях хромосом обоих представителей рода Entedon Dalman, хотя на некоторых хромосомах также обнаружены более слабые прицентромерные и/или интеркалярные сигналы.

Перспективы хромосомных исследований

            Из вышеизложенного становится ясно, что сочетание классических и современных методов, используемых для изучения хромосом паразитических перепончатокрылых из природных популяций и лабораторных культур, позволяет достичь результатов, весьма важных с точки зрения филогенетики, систематики и генетики данной группы (Гохман, 2015б). Очевидно, наиболее перспективные направления подобных исследований будут прежде всего связаны с выявлением, описанием и диагностикой криптических видов, особенно в тех таксонах, где уже отмечены различия по структуре кариотипа между близкими по происхождению формами (например, у хальцид семейств Encyrtidae, Aphelinidae, Pteromalidae и др. – см.: Гохман, 2015а). Кроме того, одновременное изучение структуры кариотипа и размеров генома паразитоидов позволит лучше понять многие вопросы геномной эволюции этих насекомых. Наконец, результаты физического картирования последовательностей ДНК могут быть весьма важны для будущих исследований по секвенированию генома наездников.

Благодарности

Данная работа частично поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований (15-04-07709).