Chironominae: проблемы систематики, эволюции и филогении

Комары-звонцы, или хирономиды подсемейства Chironominae (Chironomidae, Diptera, Nematocera) относятся к насекомым с полным метаморфозом и дезимагинизацией, крылатая стадия большинства из которых стала афагом. У насекомых с дезимагинизацией наибольшие изменения в филогенезе протекают на преимагинальных стадиях, следуя по пути совершенствования, а имаго меняются слабо, обладая более древними признаками. Поэтому при исследовании систематического положения и эволюции таксонов подсемейства Chironominae использование морфологических признаков особенно только одной стадии развития не может дать достоверных и однозначных результатов. Кроме того, сложность морфологического строения комаров-звонцов, чрезвычайное видовое разнообразие и различие в экологии видов порождают элемент предвзятости в оценке эволюционной значимости одних морфологических преобразований перед другими, и, как следствие, субъективное представление о филогении таксонов. Неизбежен комплексный подход с использованием цито- и молекулярно-генетических методов.

Подсемейство Chironominae одно из девяти подсемейств Chironomidae и второе, после Orthocladiinae, по разнообразию таксонов (Маркарченко, Макарченко, 1999). Представители этого подсемейства населяют все зоогеографические области, исключая Антарктиду (Маркарченко, Макарченко, 1999). К настоящему времени по существующим сводкам (Coffman, Ferrington, 1996;Макарченко, Макарченко, 2006;Cranston, Martin, 2007;www.eol.org; www.animaldiversity.ummz.umich.edu; www.insects.ummz.lsa.umich.edu; www.boldsystems.org; www.faunaeur.org; www.taxonomy.nl) подсемейство Chironominae представлено тремя трибами - Chironomini, Tanytarsini и Pseudochironomini, включающими свыше 90 родов. К трибе Chironomini относится не менее 69 родов, к Tanytarsini - не менее 16, к Pseudochironomini - не менее пяти.

Реконструированная нами схема (рис. 1) эволюции нуклеотидной и аминокислотной последовательностей первой субъединицы цитохром С оксидазы Chironominae показала существование четырех эволюционных линий гена COI, три из которых соответствуют трибам Tanytarsini (=Tanytarsini), Pseudochironomini (=Pseudochironomini – Riethia+ Endochironomus+Synendotendipes+Polypedilum+Sergentia) иChironomini (= Chironomini – Stenochironomus–Endochironomus–Synendotendipes–Sergentia–Polypedilum+Riethia).

Четвертая линия, соответствующая Stenochironomus, значительно обособлена от трех остальных и возможно представляет собой линию отдельного подсемейства, что позволило скорректировать систематическое положение ряда таксонов внутри семейства в целом (Демин, 2011; Демин и др., 2011; Полуконова и др., 2013). Однако постоянно описывающиеся новые виды и рода могут изменить статус уже известных крупных таксонов.

Наличие в клетках слюнных желез личинок комаров-звонцов политенных хромосом (ПХ) не только сделало их излюбленным цитогенетическим объектом для изучения функционирования интерфазных хромосом эукариот (Кикнадзе, 1972; Жимулев, 1992), но и способствовало лучшему пониманию путей эволюции кариотипа этой группы насекомых на самом высоком уровне – уровне дзета-кариологии (White, 1978), а также наметило определенный этап в совершенствовании комплексного подхода – сопоставлению хромосомной и морфологической дивергенции видов в ходе их эволюции (Шобанов, 1990, 2000, 2002; Полуконова, 2005).Для представителей подсемейства Chironominae трибы Chironomini круг цитогенетических показателей, которые можно было использовать в систематике, расширился за счет возможности анализа дисковой структуры ПХ и на этой основе идентификации хромосомных плеч (Keyl, 1962; Белянина, 1983; Петрова, 1993; Кикнадзе и др., 1991, 1996; 2004; Шобанов, 1994 а, б; Гундерина, 2001; Дурнова, 1998, 2010;Полуконова, 2005; Durnovaetal., 2015 и др.).

Самым крупным родом трибы Chironomini является Chironomus, он насчитывает более 120 видов обитающих ныне на всех материках кроме Антарктиды (Шобанов др., 1996). Существуют разные точки зрения на подродовой состав Chironomus: зарубежные исследователи только на основании сходства рисунка дисков ПХ выделяют четыре подрода: Chironomuss. str., Camptochironomus, Lobochironomus, Chaetolabis (Cranstonetal., 1989). В то время, как российские исследователи считают Camptochironomusотдельным родом, учитывая серьезные отличия в морфологии и этологии имагинальной стадии (Шобанов др., 1996; Полуконова, 2005). В результате с учетом нового подрода Нalochironomus(Сhironomus), включающего виды Chironomus группы albidus из Каспийского моря (Полуконова и др, 2005; Белянина и др., 2005), Chironomus, с нашей точки зрения, представлен четырьмя подродами - Chironomuss. str., Нalochironomus, Lobochironomus, Chaetolabis.

Рода, наиболее близкие к Chironomus – Baeotendipes, Einfeldia, Camptochironomusи Benthalia, в совокупности представлены примерно 18 видами. Chironomus являетсяодним из наиболее эволюционно молодых родов бентосных хирономид (Соколова, 1983; Кикнадзе и др., 1991; Шобанов, 2000). Его виды находятся на разных этапах эколого-морфологической и хромосомной дифференциации (Гундерина, Кикнадзе, 2000; Полуконова, 2005), в связи с чем, представляют собой удобную модель для исследования начальных этапов не только дифференциации внутри групп близкородственных видов, но и эволюции в целом.

Внутриродовая дифференциация Chironomus очень сложна, и создает массу трудностей для систематиков. Так, согласно гидробиологической классификации личинки Chironomus различаются наличием и степенью развития латеральных и вентральных отростков VII и VIII брюшных сегментов; выделяют три личиночных типа: salinarius, tummi, plumosus (Липина, 1928) не имеющих таксономического статуса. Кариотипическая классификация, основанная на межвидовой изменчивости последовательностей дисков в гомологичных плечах ПХ и комбинации хромосомных плеч, привела к выделению 17 цитологических комплексов (Keyl, 1962; Wülker, Klötzli, 1973; Martinetal., 1974), не имеющих таксономического статуса. Кроме того, выделяют еще близкородственные виды и ассоциации видов-двойников, объединяющиеся в т. н. группы видов (Devaietal., 1983; Ryseretal., 1983; Шобанов, 1989 и др.). Группа видов – также нетаксономическая (или квазитаксономическая категория), объединяющая эволюционно близкие виды, сходные по морфологии и кариотипу (Шобанов и др., 1996). При этом часто для групп видов отсутствуют четкие диагностические критерии, объединение осуществляется по принципу относительного сходства. Все представители группы – морфологические двойники, надежно различающиеся только по хромосомным показателям, как по ряду последовательностей дисков ПХ, так и по размерам прицентромерного гетерохроматина.

Даже, несмотря на сложность, более или менее понятную картину внутриродовой группировки все-таки нарушают изредка встречающиеся исключения. Такие, как Chironomuspolonicus(=Ch. kabardensis(Кармоков, Полуконова 2012; Кармоков, 2013), который по строению личинки (в частности, неокрашенному ГС) и структуре кариотипа (сочетанию хромосомных плеч - AE, CD, BF)близок видам цитокомплекса pseudothuimmi, а по имаго, в частности, по строению верхних придатков (SVо) гениталий самца С-типа – видам thummi-комплекса. В то время, как у имаго видов комплекса pseudothuimmiSVо формы «башмачка» (Strenzke, 1959). Другим примером исключения является представитель подрода Chironomuss. str. - Ch. novosibiricus (Кикнадзе, Истомина, 2000), по сочетанию хромосомных плеч(AB, CF, GED) относящийся к цитокомплексу modifiedcamptochironomus, более близкому видам Camptochironomus.

Особенности цитогенетического метода

Основными цитогенетическими критериями служат особенности организации ПХ из клеток слюнных желез личинок. При характеристике кариотипа используют такие показатели, как число хромосом (2n), сочетание хромосомных плеч, степень конъюгации гомологов, локализация и выраженность центромерных районов, количество прицентромерного гетерохромотина, число, локализация и степень развития активных районов ПХ – ядрышковых организаторов (ЯО), колец Бальбиани (КБ), крупных пуфов, а также последовательность дисков ПХ (Кикнадзе, 1972). Благодаря принципу эволюционной уникальности хромосомных перестроек их используют для реконструкции филогенетических отношений между видами (Wuelker, 1980; Шобанов, 2000; Шобанов, Зотов, 2001; Полуконова, 2003 б).

Среди комаров-звонцов представители подсемейства Chironominae лучше других изучены цитогенетически – кариотипы известны для 188 видов из 24 родов, из них 180 видов из 20 родов принадлежат самой большой по объему трибе Chironomini. Для большинства Chironominae характерен хромосомный полиморфизм инверсионного типа (Keyl, 1962; Кикнадзе и др., 1991 и др.), изучение которого важно для понимания микроэволюции этой группы насекомых. Инверсионные разломы в хромосомах, в основном, приходятся на строго определенные диски или междисковые районы – «горячие точки» в геноме (Стегний и др., 1976). На основании анализа структуры ПХ у комаров-звонцов был вскрыт принцип их эволюции – образование внутри цитокомплексов больших групп видов-двойников (Кикнадзе и др., 1991). Признаками, дифференцирующими эти виды-двойники, могли быть только специфические фиксированные комбинации хромосомных последовательностей, отличающиеся между собой одной или несколькими последовательными и параллельными инверсиями (Keyl, 1962; Kiknadze, 1987; Кикнадзе и др., 1996). В качестве интегрирующего признака кариотип выступает в тех случаях, когда он способствует объединению видов в роды, а родов – в систематические группы более высокого ранга и используется в решении проблем эволюции надвидовых таксонов. Особенности рисунка дисков ПХ у комаров-звонцов пока возможно использовать только при анализе близких родов, таких, как Chironomus, Camptochironomus, Baeotendipes и др. (Шобанов и др., 1996).

Несмотря на значительный прогресс в изучении кариотипов комаров-звонцов, проследить пути их эволюции на основании подсчета инверсионных шагов возможно только для Chironomus, что связано с эволюционной молодостью этого рода и наличием у его видов гомологичных участков хромосом, отсутствующих у большинства других родов подсемейства Chironominae. Такая гомология могла быть утеряна за счет большого количества структурных хромосомных перестроек, произошедших между видами как внутри, так и между родами и более высокими таксонами (Кикнадзе и др., 1996).

Хромосомный анализ проводится обычно для выявления родственных связей слабо различающихся между собой по морфологии видов хирономид в пределах рода. Его преимуществом служит надежность при определении вида (Белянина и др., 1990; Белянина и др., 1992; Белянина, Логинова (Полуконова), 1993 а-в; Логинова (Полуконова), Белянина, 1994; Белянина и др., 2000; Истомина и др., 2000; Полуконова и др., 2003, 2005; Кармоков и др., 2014; Karmokovetal., 2015), а недостатком – трудоемкость, невозможность оценки родственных связей удаленных таксонов (хорошо дифференцированных родов, триб), что делает данный метод недоступным для использования в систематике подсемейства Chironominae.

Хромосомный полиморфизм, эволюция кариотипа и дифференциация видов

Особенности хромосомного полиморфизма видов с аллопатрическим и симпатрическим обитанием. Близкородственные виды хирономин с аллопатрическим распространением могут характеризоваться отсутствием инверсионного полиморфизма (Ch. bonusиCh. plumosus) или очень низким его уровнем (Ch. piger и Ch. riparius;Ch. curabilis и Ch. nuditarsis, Microtendipessp. из группы pedellus и Microtendipespedellus), но в этом случае обычно различаются по количеству гетерохроматина (Полуконова, 2005). Близкородственные виды хирономид с симпатрическим распространением: Camptochironomus (Полуконова и др., 2005 а, б) и большинство Chironomus (Белянина и др.., 1992 Полуконова, 2004 а, б; 2005) обладают сравнительно высоким уровнем инверсионного полиморфизма, за исключением совместно обитающих Ch. dorsalis и Ch. sp. из группы dorsalis, которые хромосомно мономорфны (Белянина, Логинова (Полуконова, 1993 а).

Роль хромосомного полиморфизма в эволюции видов. Унифицированная нами типология последовательностей ПХ Chironomus группы plumosus (рис. 2) с четырьмя типами последовательностей ПХ (Полуконова, 2005), позволила оценить роль разных типов последовательностей в эволюции и адаптации видов.

I тип – межвидовые гомологичные последовательности (13.1% от общего числа последовательностей группы plumosus); преобладание которых у какого-то вида указывает на его наибольшее сходство с исходным в группе.II тип – внутривидовые базовые последовательности(12.4%), служат хромосомным «портретом» вида и составляют стабильную часть генома вида. Чем больше у вида последовательностей этого типа, тем дальше он удален от исходного в группе. III тип – редкие внутривидовые последовательности (31.4%), представляют варьирующую часть кариофонда вида, встречаются с низкой частотой (1–2%) и в гетерозиготном состоянии.IV тип – часто встречаемые внутривидовые последовательности(43.1%), присутствуют не в каждой популяции, усиливают межвидовую дифференциацию. Частота встречаемости личинок с этим типом последовательностейможет достигать 50% и более.

Уровень полиморфизма за счет последовательностей IV типа и наличие последовательностей III типа в популяциях Chironomus могут быть использованы при характеристике реакции генома хирономид на воздействие среды.

Исходным в группе plumosus обычно рассматривался Ch. plumosus (Кикнадзе и др., 1996; Шобанов, 2000). По нашим данным, о близости Ch. plumosusк исходному виду свидетельствует преобладание в кариофонде последовательностейI типа. Наличие у этого вида последовательностейIII типа, определяющее его приспособительные возможности на основе инверсионного полиморфизма, по-видимому, делает неспособным такой вид генерировать дочерние. Пути образования видов с идентичными последовательностями II типа - Ch. plumosus и Ch. bonusот исходного, вероятно, связаны с перераспределением гетерохроматина в геноме, что свойственно гомосеквентным видам (Стегний, 1991).

Эволюция кариотипа Ch. bonus, по-видимому, шла за счет аккумуляции гетерохроматина в В-хромосоме, а Ch. plumosus – распределения гетерохроматина по хромосомным плечам, способствуя включению «горячих точек» и переходу к полиморфному виду. Отсутствие у Ch. plumosus и Ch. bonus видоспецифичных базовых последовательностей подтверждает значимость гетерохроматина в эволюции кариотипа и указывает на возможность возникновения видов без изменения базовых последовательностей.

Для Ch. balatonicus, Ch. entis, Ch. muratensis, Ch. nudiventris отмечены другие пути эволюции кариотипа. Общим для этих видов служит наличие в кариофондах последовательностей I типа, не превышающее числа хромосомных плеч, и обязательное присутствие базовых последовательностей II типа, число которых (3–5) показывает удаленность этих видов от исходного. Выделены комплексы базовых последовательностей II типа, на основе которых происходила эволюция их кариотипов; межвидовая дифференциация кариотипаов этих видов усиливалась за счет негомологичных последовательностей III и IV типов.

Регистрация микроэволюционных процессов в популяциях одного вида.Анализ инверсионного полиморфизма Ch. nuditarsis предгорных и горных популяций (Полуконова, Кармоков, 2013; Кармоков, 2013) позволил зарегистрировать микроэволюционные процессы. Было установлено, что с увеличением высоты расположения водоема н.у.м. снижаются частоты зиготического сочетания ndtB2.2 и возрастает частота ndtG2.2. Значения цитогенетической дистанции между горной и предгорными выборками больше среднего (0.138) и варьируют от 0.174 до 0.223. Фактором, ограничивающим панмиксию и препятствующим обмену генами между предгорными и горными популяциями, может служить низкая температура воды высокогорных водоемов. Длительное препятствие обмена генами между предгорными и горными популяциями может привести к образованию нового вида.

Молекулярно-генетические методы и их возможности

Молекулярно-генетические методы в систематике и филогенетике основаны на выявлении сходств и различий между нуклеотидными или аминокислотными последовательностями исследуемых организмов. Использование такого подхода имеет ряд неоспоримых преимуществ перед традиционными – морфологическим и цитогенетическим. Во-первых, эволюционные изменения ДНК- и аминокислотных последовательностей протекают более плавно, чем изменения морфологических и цитогенетических признаков (Гурьев, 2002; Демин, 2011). Вследствие этого, степень сходства ДНК- и аминокислотных последовательностей напрямую зависит от эволюционной удаленности организмов, что позволяет проводить более точные реконструкции родственных связей (Жимулев, 1992). Во-вторых, при проведении молекулярной реконструкции обычно используются сотни и тысячи признаков, выраженные в изменчивости отдельных нуклеотидов или аминокислот сравниваемых последовательностей (Лухтанов, Кузнецова, 2009), в то время, как морфологические или цитогенетические методы реконструкций обычно оперируют несколькими десятками признаков (Павлинов, 2005). В-третьих, молекулярно-генетические данные проще морфологических и цитогенетических поддаются математической обработке, вследствие их сравнимости и воспроизводимости (Абрамсон, 2009). Для этих целей к настоящему моменту разработано множество программ использующих различные методы и алгоритмы оценки эволюционных связей ДНК- и аминокислотных последовательностей, позволяющих проводить молекулярно-генетические реконструкции в относительно короткие сроки, избегая излишнего субъективизма.

Основным способом отображения молекулярно-генетической информации служит графическая визуализация в виде дендрограмм, показывающих родственные связи ДНК или белков. При правильном выборе молекулярно-генетического маркера (гомологичного участка ДНК или белка, полиморфного у сравниваемых таксонов), полученная дендрограмма может отображать филогенетические взаимоотношения между организмами (Абрамсон, 2007).

Молекулярно-генетичекий подход включает в себя множество точных методов, ведущим из которых является секвенирование отдельных фрагментов генома или установление первичной нуклеотидной последовательности. При правильном выборе генетических маркеров, полученные данные легко сравниваются даже между отдаленными таксонами, что позволяет в максимальном приближении взглянуть на ход эволюции, сводя её к точечным мутациям и структурным перестройкам отдельных генов или сателлитной ДНК (Банникова, 2004).

Процесс секвенирования автоматизирован, и для обработки его результатов к данному моменту создано множество специализированных компьютерных программ, таких как CROMASPRO, PAUP, MEGA, ARLEQUINE, OLIGO, LASERGENE, GENETREE, DNASTAR, GENERUNNER и др. Однако самые точные сведения об эволюции видов дает расшифровка всей ДНК, но секвенирование полных геномов является пока малодоступным для массового применения в филогении. Поэтому в настоящее время при проведении филогенетических реконструкций, в том числе у комаров-звонцов, широкое применение получило использование отдельных маркерных фрагментов ДНК. Помимо секвенирования применяются и менее информативные молекулярно-генетические методы, позволяющие комплексно анализировать эволюцию всей ДНК или ее составных частей: RAPD, RFLP, ISSR, AFLP и др. Из них для анализа филогенетического родства в подсемействе Chironominae пока применялся только RAPD (Гундерина и др., 2009) и RFLP (Sharleyetal., 2004).

Быстрое накопление информации о структуре нуклеотидных и аминокислотных последовательностей различных организмов привело к необходимости создания молекулярно-генетичсеких баз данных. К настоящему моменту огромный пласт информации о последовательностях ДНК и аминокислот живых организмов, содержащийся в молекулярных базах данных, позволяет проводить самые разнообразные научные изыскания с привлечением информации, полученной независимыми группами исследователей со всего земного шара (Wilson, Goodman, 2008). Активные исследования молекулярной организации Chironomus начались с 1982 года, когда впервые была установлена частичная нуклеотидная последовательность гена КБ₂ для C. pallidivittatus (Jackleetal., 1982). Получены молекулярные характеристики генов, отдельных их участков и структурно-функциональных зон ПХ – центромер, теломер, ЯО, КБ, экдизоновых и температурных пуфов (Кикнадзе и др., 1989). Открытие у хирономид мобильных генетических элементов (МГЭ), выявленных первоначально при клонировании фрагментов ДНК КБ Ch. riparius, послужило одним из важных результатов их молекулярно-цитологического исследования, так как МГЭ рассматриваются как важный фактор видообразования (Кикнадзе и др., 1989).

К настоящему времени у видов наиболее широко распространенных родов подсемейства Chironominae – Chironomus, Camptochironomus, Polypedilum, Tanytarsus, Paratanytarsus, Micropsectra – частично или полностью определена нуклеотидная структура более чем 50 генов, а также структура некоторых мобильных генетических элементов, тандемных повторов и некоторых других некодирующих участков генома (www.ncbi.nlm.nih.gov). У многих видов хирономид исследованы, в основном, митохондриальные гены – гены первой и второй субединиц цитохром C оксидазы - COI, COII и цитохрома b (СytB), а из ядерных – гены EF-1α, ssp160, гены кодирующие структуру гемоглобина - gb2b и gbIX, ген 18S рДНК и ген карбомаилфосфат синтетазы (CAD) (www.ncbi.nlm.nih.gov). Нуклеотидные последовательности большинства других генов установлены для четырех видов – двух видов рода Chironomusиз группы riрarius – Сh. riрarius, Ch. piger и двух видов Camptochironomus – С. tentans и C. pallidivittatus.

Применение гена COI мтДНК в молекулярной филогении. Среди множества возможных молекулярно-филогенетических маркеров одно из лидирующих мест, как по кругу решаемых задач, так и по объему проводимых исследований, принадлежит мтДНК. Митохондриальный геном многоклеточных животных имеет размер 15000-17000 пар нуклеотидов, что составляет приблизительно 1/10000 от наименьшего ядерного генома животных. Поэтому, по сравнению с ядерным геномом, получить чистые препараты мтДНК достаточно просто. Митохондриальные гены, как правило, уникальны, редко перекрываются и не содержат интронов. Структура митохондриального генома довольно стабильна: 13 белок-кодирующих генов, 2 гена рРНК, 22 гена тРНК и контрольный регион, содержащий сайты инициации, репликации и транскрипции (Сингер, Берг, 1998). Наследование мтДНК осуществляется по материнской линии. Эволюционные изменения происходят без участия рекомбинации связанных с кроссинговером, преимущественно, за счет точечных мутаций, инсерции и делеции сравнительно редки, что позволяет использовать гены мтДНК для оценки времени дивергенции таксонов с применением гипотезы молекулярных часов (Демин, 2011; Полуконова и др., 2013).

У большинства позвоночных животных при проведении молекулярно-генетических реконструкций в качестве маркера наиболее часто используется ген CytB мтДНК (Банникова, 2004; Полуконова и др., 2013 а, б), благодаря тому, что подбор праймеров, обеспечивающих его ПЦР-амплификацию, не представляет сложности. Проблема поиска универсальных праймеров для беспозвоночных животных долгое время оставалась сдерживающим фактором широкого применения молекулярно-филогенетического подхода в изучении их эволюции до тех пор, пока не были разработаны универсальные праймеры для фрагмента гена СОI(Folmeretal., 1994). Ген СОI считается одним из наиболее эволюционно консервативных в митохондриальном геноме (Wolstenholme, Clary, 1985), что позволяет проводить изучение филогении далеких таксонов. В то же время, наблюдаемое количество синонимичных замен достаточно для проведения исследований на межвидовом и популяционном уровнях (Folmeretal., 1994; Полуконова и др., 2013 а, б; Дурнова и др., 2014). Число эволюционных работ по беспозвоночным животным с использованием последовательностей гена СОI в последние годы стремительно возрастает, следовательно, этот маркер можно рассматривать как наиболее перспективный для филогенетических исследований.

Крупнейшая из баз – GeneBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) содержит сведения более 1900 нуклеотидных последовательностях, принадлежащих 1255 видам Chironomidae. Из них на долю самого изученного гена семейства - COI митохондриальной ДНК, приходится 2/9 части от общего числа последовательностей, установленные для 215 видов. Возросший в последнее время интерес к изучению этого гена связан не только с уникальными особенностями его наследования и эволюции (Huangetal., 2008), но и с началом реализации проекта «BarcodingOfLife», предполагающего ДНК-штрихкодирование всех живых организмов на основе последовательности гена COI. В созданной для реализации этого проекта базе данных – Bold-system (www.boldsystems.org) на настоящий момент находится

информация о более чем 3200 последовательностях гена COI, принадлежащих 300 видам подсемейства Chironominae. Совокупность изложенных данных делает ген COI самым привлекательным молекулярным маркером для эволюционных исследований в подсемействе Chironominae.

Нами выявлены особенности эволюционной изменчивости 5'-концевого фрагмента гена COIв подсемействе Chironominae (Демин, 2011; Демин, Полуконова, 2014). Показано, что в 97% вариабельных нуклеотидных сайтов этого гена наблюдаются эволюционно нейтральные замены. Установлено (Демин и др., 2011), что уровень аминокислотной изменчивости лучше нуклеотидной отображает молекулярные границы рода, трибы и подсемейства. Показано, что использование аминокислотной последовательности позволяет точнее нуклеотидной дифференцировать друг от друга виды разных родов и определять положение таксонов надродового уровня.

Применение гипотезы молекулярных часов для расчета времени дивергенции хирономид. Одной из трудноразрешимых задач при исследовании эволюции комаров-звонцов является датировка эволюционных событий. Палеонтологические исследования затруднены сложностью родовой (не говоря уж о видовой) идентификации хирономид, и, как известно, носят единичный характер. Решением данной проблемы на молекулярно-генетическом уровне может стать применение гипотезы молекулярных часов (Zuckercandl, Pauling, 1965), согласно которой для любой макромолекулы (ДНК или белка) скорость накопления замен постоянна во всех эволюционных линиях. Такое предположение получило объяснение в рамках теории нейтральности молекулярной эволюции (Kimura, 1968). По данной теории большинство изменений на молекулярном уровне определяется не отбором, а селективно нейтральными или почти нейтральными случайными процессами мутации и дрейфа генов.

Важнейшее практическое приложение гипотезы молекулярных часов состоит в возможности получения временных оценок дивергенции организмов, исходя из анализа молекулярных данных. Несмотря на существующие противоречия, гипотеза молекулярных часов принята многими эволюционистами и используется для оценки времен дивергенции различных таксонов. Для проверки предположения о существовании молекулярных часов разработано несколько статистических тестов. Так, тест на относительные скорости эволюции – «relativeratetest» (Tajima, 1993), нацелен на проверку предположения о равенстве скоростей эволюции у двух родственных таксонов в сравнении с внешней группой. Подобный ему метод сравнения длин ветвей – «branch-lengthtest» (Takezakietal., 2004), выявляет отклонения длины отдельных ветвей от средней длины для всего древа.

Для применения гипотезы молекулярных часов наилучшим образом подходит мтДНК, так как изменение входящих в ее состав генов хорошо согласуется с теорией нейтральности (Knowltonetal., 1993). Калибровке хода молекулярных часов в генах мтДНК различных организмов посвящено множество работ (Knowltonetal., 1993; Papouchevaetal., 2003 и др.). Основными генами, используемыми для калибровки молекулярных часов у насекомых, являются: CytB, COII, COI и ген NADH4, кодирующий четвертую субъединицу НАДН-дегидрогеназы.

Большинство современных исследователей указывают рамки скоростей дивергенции последовательности гена COI у насекомых в интервале от 1.5% до 2.3% в 1 млн. л. (Jamnongluketal., 2003; Marketal., 2006 и др.). Следовательно, скорость эволюции ДНК составляет от 0.0075 до 0.0115 замен на сайт за 1 млн. л. Данные о скорости дивергенции генов в различных эволюционных линиях часто получают, используя палеонтологических останков родоначальников исследуемых эволюционных линий (Wheat et al., 2007). Большие перспективы при калибровке молекулярных часов в подсемействе Chironominae имеет использование палеонтологических датировок ископаемых останков первых представителей семейства Chironominae и, в частности,Aennetriassica, обитавшего210 млн. л.н. (Krzeminski, Jarzembowski,1999).

На основе анализа эволюционной изменчивости аминокислотной последовательности, кодируемой геном COI, определена датировка эволюционных событий и получена хронограмма подсемейства Chironominae(Демин, Полуконова, 2008; Демин, 2011; Демин и др., 2011; Полуконова и др., 2013). Показано, что дивергенция хирономиды Stenochironomusgibbus происходила вместе с предковой формой Chironominae и Orthocladiinae приблизительно 135 млн. л.н. в начале мелового периода; время дивергенции трибы Tanytarsini от Chironomini и Pseudochironomini составляет около 85 млн. л.н., а трибы Chironomini от Pseudochironomini - около 66 млн. л.н.

Эволюционно значимые структурные изменения гена COI у комаров-звонцов подсемейства Chironominae. Для комаров-звонцов подсемейства Chironominae нами на основе поиска нуклеотидных сайтов, в которых несинонимичные замены были бы уникальны для каждой или нескольких эволюционных линий гена COI этого подсемейства, выявлены эволюционно значимые структурные изменения гена COI (Демин, 2011; Демин, Полуконова, 2014). Отобранные 17 аллельных вариантов последовательности COI были использованы для построения схемы эволюции гена COI (рис. 3), отражающей преобразование последовательности COI только в вариабельных сайтах 9 выявленных триплетов (всего 27 сайтов, из них 11 вариабельных).

Из 11 рассмотренных нуклеотидных сайтов только в 7 наблюдаемые несинонимичные замены приводят к изменению класса аминокислоты и, соответственно, способны повлиять на пространственную ориентацию пептидной цепи. Такие изменения затрагивают всего 5 триплетов из 9 отобранных и из 178 рассматривающихся первоначально:

1. 125 позиция – замена нуклеотида С на G (пролин – аланин) могла способствовать обособлению ветви Orthocladiinae от остальных хирономид;
2. 398, 399 позиции – замена нуклеотидов АА на GG (аспарагин – глицин) могла способствовать обособлению Orthocladiinae от общего с Chironominae предка. Замена нуклеотидов АА на GС (аспарагин – аланин) могла способствовать обособлению Stenochironomus от общего с остальными Chironominae предка. Позднее в эволюционной ветви Chironominae эта же замена или замена AG – GC (серин – аланин) могла привести к обособлению Chironomini от Pseudochironomini и Tanytarsini;
3. 410, 411 позиции – замена нуклеотидов GC на AG (аланин – серин) могла способствовать обособлению общего предка Stenochironomus и Chironominae от остальных от остальных хирономид;
4. 491 позиция – замена нуклеотида А на G (серин – аланин) могла привести к обособлению Stenochironomus от остальных хирономид;

569 позиция – замена нуклеотида A на G (треонин – аланин) могла привести к обособлению общего предка Chironominae и Stenochironomus от Orthocladiinae.

По-видимому, именно перечисленные сайты на участке 5'-концевого фрагмента последовательности гена СОI с 100 по 634 п.н. могут потенциально являться эволюционно значимыми, изменения в них, возможно, не только маркируют эволюцию хирономид, но и способны привести к изменению структурных и функциональных особенностей COI. В пределах рассматриваемого фрагмента гена COI как синонимичные, так и несинонимичные нуклеотидные замены в 97% вариабельных сайтов потенциально имеют эволюционно нейтральный характер.

Пример комплексного - цито- и молекулярно-генетического подхода к решению вопроса о видообразовании Ch. usenicus

На основе сравнительного анализа рисунка дисков ПХ Ch. usenicus, Ch. plumosus, Ch. behningi было выдвинуто предположение о новом для данной группы способе видообразования – на основе межвидовой гибридизации (Полуконова, Белянина, 2002; Полуконова, 2003а, б; Полуконова, 2005), до этого времени межвидовые гибриды считались единичными (Голыгина и др., 1997). Ch. usenicus возник, по нашему мнению, в результате гибридизации Ch. plumosus и Ch. behningi.В кариофонде Ch. usenicusв консервативном у видов Chironomus плече G (хромосома IV) существует три комбинации последовательностей – одна гомозиготная комбинация useG1(=pluG1) и две гетерозиготные – useG1(=pluG1)/ useG2 (=behG1) и useG1(=pluG1)/ useG3. Большинство особей Ch. usenicusобладают комбинацией useG1(=pluG1)/ useG2 (=behG1). Анализ последовательностей ПХ в плечах Ch. usenicusпоказал, что 75% участков ПХ в его кариотипе общие с Ch. plumosus, 12.5% – общие с Ch. behningi и 12.5% – специфичные для Ch. usenicus.

Рассматриваемая модель видообразования может выглядеть следующим образом: Ch. plumosus + Ch. behningi = Ch. usenicus, Ch. plumosus, Ch. behningi

На юге Саратовской области, где совместно обитают Ch. plumosus и Ch. usenicus (в соотношении 2: 1), Ch. behningiне обнаружен. Отсутствие Ch. behningiв зоне интрогрессии и уменьшение числа гомологичных с ним последовательностей в кариофонде вида гибридного происхождения (у Ch. usenicusиз 16 последовательностей – шесть идентичны последовательностей Ch. plumosus и три идентичны последовательности Ch. behningi) указывают на поглотительный характер интрогрессивной гибридизации.

Исследованные особи Ch. usenicus одной популяции могли отличаться между собой синонимичными заменами (транзициями) в 183 позиции (G/A), 297 (G/А) и 342 (G/A), находящимися во всех случаях в третьем нуклеотиде кодона. Выявленный нуклеотидный полиморфизм в популяцииCh. usenicus связан с его эволюционной нестабильностью в зоне интрогрессии (Полуконова, 2003а; Полуконова и др., 2009).

Дендрограмма видов группы plumosus, построенная по гену COI (Полуконова и др., 2009), показывают, что Ch. usenicus входит в группу plumosus, образуя единый кластер с видами Ch. curabilis, Ch. plumosus, Ch. entis.

Уровень различий по гену COI у Ch. usenicus из оз. Калач и у Ch. plumosus из Германии, р. Рейн (данные GenBank) не превышает внутривидового, а при симпатрическом обитании этих видов в оз. Калач – даже внутрипопуляционного уровня, что можно объяснить двумя гипотезами.

Согласно первой гипотезе, молодой вид гибридного происхожденияCh. usenicus унаследовал мтДНК от Ch. plumosus (как одного из родительских видов). Согласно второй, - Ch.usenicus имеет древнюю историю, и наличие мтДНК «плюмозусного» типа можно объяснить гибридизацией этих видов в зоне вторичного контакта. Первую гипотезу демонстрирует реконструкция образования сообщества Ch. plumosus – Ch. usenicus субаридной территории Прикаспийской низменности – оз. Калач (Полуконова, 2003а).

Вторая гипотеза, объясняющая сходство гена мтДНК Ch. usenicus и Ch. plumosus,может проистекать из возможности горизонтального переноса мтДНК, что могло произойти при вторичной встрече Ch. plumosusи Ch. usenicus на субаридной территории Прикаспийской низменности. Объяснением может служить возникновение межвидовой гибридизации с последующими возвратными скрещиваниями, в результате которых у потомков появляется мтДНК одного из родительских видов. При этом даже её незначительное селективное преимущество способно привести к быстрой фиксации нового гаплотипа в популяции (Полуконова и др., 2009).

Наиболее вероятным объяснением сходства гена COICh. plumosusи Ch. usenicus представляется наследование мтДНК Ch. usenicusот Ch. plumosus (как одного из родительских видов) в процессе асимметричной гибридизации Ch. plumosus и Ch. behningi. В настоящее время гибридных форм Ch. usenicus х Ch. plumosus в оз. Калач не было обнаружено, из чего следует, что гибридизация происходила в прошлом. По-видимому, Ch. usenicus, настолько молод в филогенетическом отношении вид, что его мтДНК и мтДНК одного из родительских видов – Ch. plumosus недостаточно дивергировали друг от друга. Наличие у Ch. plumosusи Ch. usenicus общего митохондриального гаплотипа «плюмозусного» типа, в то время, как по хромосомным показателям виды достаточно четко дифференцированы, отражает, по-видимому, разную скорость их дивергенции в ходе эволюции – хромосомная дифференциация видов происходит наиболее быстро и опережает как молекулярную дивергенцию гена COI, так и морфологическую.