В структуре детской заболеваемости болезни органов мочевыделительной системы занимают второе место после респираторной патологии [1]. Увеличение заболеваемости нефропатиями, учащение первично хронических вариантов течения, вызывает обеспокоенность и указывает на необходимость дальнейшего изучения этиологии, механизмов развития и прогрессирования болезней почек [2]. До настоящего времени остается актуальной проблема происхождения нефропатий у детей. Существование большого разнообразия причин, ведущих к возникновению нефропатий, затрудняет решение вопроса о выборе адекватной этиотропной и патогенетической терапии, оценку эффективности методов лечения [3, 4]. Некоторые заболевания почек, которые манифестируют в дошкольном и школьном возрасте, берут свое начало еще в антенатальном и пренатальном периодах. [5]. Мысль о скрытых причинах возникновения нефропатий привела к попытке оценить влияние пищевых факторов на почки детей. В качестве пищевого фактора был выбран пищевой краситель – тартразин (Е 102), который широко используется в производстве напитков, мороженого, кондитерских изделий (конфет, драже, зефира, мармелада и др.). Несмотря на официальное разрешение использования тартразина в пищевой промышленности России и Украины, исследования индийских врачей свидетельствуют о появлении таких побочных эффектов тартразина, как аллергические реакции, у 3,8-4,2% пациентов [6]. Особая восприимчивость к тартразину, в частности, раздражительность, гиперактивность, беспокойный сон, была выявлена у детей [7].

Цель исследования: усовершенствовать диагностику и прогноз риска развития  и прогрессирования нефропатий на основании углубленного клинико-экспериментального изучении роли обмена фосфолипидов под действием пищевых красителей.

Материалы и методы исследования: Эксперимент проведен на крысах – самках и самцах линии Вистар. Самки крыс получали по 1мл 0,1% раствора тартразина (в дозах, разрешенными стандартами для использования в пищевой промышленности) на протяжении 1 месяца. Крысы пребывали в стандартных условиях вивария. Часть крыс (7 самок основной и 7 самок контрольной групп) была подсажена к самцам.  Во время беременности и кормления потомства самки продолжали получать тартразин. Часть потомков крыс выведены из эксперимента в возрасте 1 месяца (эквивалентно детскому возрасту), часть - в возрасте 2 месяцев (эквивалентно подростковому возрасту). 1-месячные крысята получали тартразин только через плаценту внутриутробно и с материнским молоком, а 2-месячным крысятам  - дополнительно в течение   1 месяца вводился тартразин внутрижелудочно в той же дозе, что и их матерям. Контрольные группы – интактные животные такого же возраста – получали 1мл физиологического раствора.

В сыворотке крови крыс определяли содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) - малонового диальдегида (МДА) и диеновых коньюгат (ДК) спектрофотометрическим методом; белковый состав сыворотки крови определяли турбодиметрическим методом с помощью реагентов фирмы Ольвекс (Россия); содержимое FAS-лиганда - с помощью набора реагентов фирмы Bender Medsistem (Австрия); уровень молекул средней массы (МСМ) – спектрофотометрическим методом; мочевину, креатинин и активность аминотрансфераз - с помощью наборов реагентов фирмы La Chema (Чехия); активность каталазы – спектрофотометрическим методом; содержимое в гомогенатах почечной ткани общего белка - спетрофотометрически, липидов (триглицеридов, холестерина, фосфолипидов, общих липидов) - с помощью наборов реактивов фирмы Ольвекс (Россия).

Материал  для морфологического исследования — правую почку после фиксации в 10% формалине заливали в парафин, а срезы толщиной 5-6 мкм красили пикрофуксином по Ван Гизу, ставилась ШИК-реакция для четкого выявления базальных мембран клубочковых капилляров. Световая микроскопия проводилась с использованием микроскопов Olympus BX-41 (Япония) и Zeiss.

Нами обследовано 79 детей в возрасте от 1 до 18 лет, из них с гломерулопатиями - 28 человек, с хроническим пиелонефритом – 51 детей.  Верификация диагнозов проводилось на основе тщательного клинико-лабораторного и инструментального обследования больных по общепринятым методикам.

В группе детей с гломерулопатиями было больше детей старшего возраста, по полу - мальчиков. В группе детей с пиелонефритами – отношение мальчики/девочки зависело от возрастной группы (с увеличением возраста больных увеличивался процент девочек).

В структуре пиелонефритов превышали вторичные пиелонефриты на фоне врожденных аномалий развития мочевыводящей системы, пузырно-мочеточниковых рефлюксов, нейрогенной дисфункции мочевого пузыря, метаболических нарушений. Следует отметить, что часто даже тщательный анализ анамнестических данных (наследственность, течение беременности) для выявления возможных причин (генетических, биологических, физических, химических и др.) развития врожденных пороков почек и мочевыводящих путей не позволил идентифицировать причину их развития у детей. Выше сказанное позволяет допустить, что такими причинами могут быть пищевые продукты, содержащие те или иные красители  и стабилизаторы. Путем анкетирования была выявлена частота употребления детьми продуктов, содержащих тартразин. При этом дети с гломерулопатиями употребляли тартразин в 2 раза чаще, чем дети с пиелонефритом.

В сыворотке крови детей определяли фосфолипидный обмен (общие фосфолипиды, лизофосфотидинхолин, сфингомиелин, фосфатидилхолин, фосфатидилинозитид, фосфатидилэтаноламин, фосфатидная кислота, фосфатидилсерин) методом В.С. Камышникова (2004), содержание в мочи гликозаминогликанов по П.Н. Шараеву с соавтор. (1987), уровень холестерина – по методу S.Ilca (1962).

Все полученные цифровые данные обработаны статистическими методами исследования.

Результаты исследования: В результате экспериментального исследования в сыворотке крови 1-месячных потомков основной группы по сравнению с контрольной группой повышен уровень β-глобулинов при существенном снижении уровня альбуминов, что можно расценить как нефротический тип протеинограммы (табл.1).

Кроме того, у крысят основной группы установлено повышение значения γ-глобулиновой фракции, что может быть связано с активацией гуморального звена иммунитета (табл.1).

Получение тартразина внутриутробно и с молоком матери 1-месячными потомками способствует увеличению FAS-лиганда в сыворотки крови. Продолжение употребления тартразина 2-месячными потомками показало увеличение FAS-лиганда, особенно у самцов (рис.1). Этот факт вместе с фактом увеличения γ-глобулиновой фракции протеинов можно расценить как наличие аутоиммунного процесса.

Увеличение креатинина (рис. 2) и мочевины крови (рис. 3) при длительном употреблении тартразина у крысят основной группы по сравнению с контролем, могут рассматриваться как критерии функциональных нарушений в почках. Из рис. 1, 2 видно, что чем дольше животное употребляет тартразин, тем больше выражены функциональные нарушения в почках. При этом у самцов  повышение уровня мочевины и креатинина больше, чем у самок.

У 1-месячных самцов основной группы увеличена активность АсАт и АлАт, снижено содержание общего белка (табл.2), увеличен уровень липидов (преимущественно за счет триглицеридов, при снижении содержания фосфолипидов) (табл.3).

У самок увеличена активность АсАТ и АлАТ при повышенном, относительно группы контроля, содержании белка (табл.2). Содержание общих липидов не отличается от уровня у контрольных животных, но содержание в сыворотке фосфолипидов снижено, а триглицеридов – увеличено (табл.3).

У самцов активированы процессы ПОЛ (содержание  МДА и ДК выросло) при снижении активности антиоксидантной системы (активность каталазы снижена). У самок активность каталазы не отличается от уровня каталазы у контрольных животных (табл.4).

У 2-х месячных крысят-потомков самок, которые получали тартразин за месяц до беременности, во время беременности и в период кормления, также изучено состояние прооксидантно-оксидантной системы. Как видно из полученных данных, у самок основной группы активируются как процессы ПОЛ, так и активность ферментов антиоксидантной системы (табл. 5). Возможной причиной активации процессов ПОЛ является токсичность тартразина для животных.

Известно, что степень токсичности вещества, которое вводится в организм, можно оценить по содержанию молекул средней массы. Изучение этого показателя в сыворотке крови показало, что уровень МСМ в среднем в 2 раза больше, чем у животных контрольной группы (табл.5). Как видно, токсическая нагрузка приводит к активации процессов ПОЛ, компенсаторно увеличивается активность ферментов АОС. У самцов основной группы содержание продуктов ПОЛ ниже, чем в контрольной группе, а активность ферментов АОС не отличается от контрольной группы.

Изучение содержания липидов в гомогенатах почечной ткани показало, что у самцов и самок основной группы снижен уровень фосфолипидов при повышенном содержании холестерина, что может быть связано с нарушением уровня у транспортных форм липидов в крови (табл.6). Уменьшение уровня фосфолипидов может быть причиной обновления фосфолипидного компонента мембран и, в связи с этим, с изменением транспорта через мембраны нефроцитов и регуляторных процессов в почечной ткани.

Таким образом, полученные результаты позволяют допустить, что у 1-месячных животных основной группы, особенно у самцов, имеет место дисбаланс в системе ПОЛ и антиоксидантной активности в почках, что указывает на нарушения в протекании метаболических процессов в целом. У самцов и самок наблюдаются также нарушения в синтезе и содержании липидов. Вероятно, снижение уровня фосфолипидов связано с наработкой антифосфолипидных антител (аутоиммунный процесс).

Анализ результатов проведенного исследования 2-месячных крысят-потомков, которые получали тартразин внутриутробно, с молоком матери, а после перехода на самостоятельное питание в течение 1 месяца самостоятельно употребляли тартразин с пищей, свидетельствует о том, что у этих животных нарушены метаболические процессы в почках: снижен уровень фосфолипидов при повышенном уровне холестерина. Изменения со стороны метаболических процессов приводит к функциональным нарушениям, о чем свидетельствует повышение уровня креатинина и мочевины в крови животных основной группы. При этом, чем дольше животное получает тартразин, тем больше выражены метаболические  и функциональные нарушения со стороны почек. Исходя из данных биохимических исследований, можно допустить, что у самцов, которые получали тартразин, нарушения функций почек выражено больше, чем у самок.

Морфологически у 1-месячных крысят, получавших тартразин внутриутробно и с материнским молоком, клубочки почек размещены в коре неравномерно. Значительная часть клубочков редуцированные, представлены малым количеством капилляров (рис.4). Нормально развитые клубочки функционируют  с повышенной нагрузкой, они гипертрофированы. Появление Ig G и увеличение количества макрофагов в некоторых клубочков свидетельствует о формировании иммунного поражения и воспаления клубочков (рис.5). Морфологическая картина поражения эпителия канальцев, местами со скоплениями макрофагов в строме может свидетельствовать о начале развития тубуло-интерстициального нефрита.

Если особь с внутриутробным началом поступления тартразина в организм продолжает получать его и после рождения, действующие клубочки выглядят гипертрофированными. При этом в них определяется большое количество макрофагов (рис.6), встречаются активные фибробласты, интенсивно идет процесс склероза как стенки капилляров, так и мезангиума (рис.7).

Таким образом, у крысят эквивалентных «подростковому» возрасту имеются гистологические признаки хронического гломерулонефрита. Значительное поражение эпителия канальцев с накоплением макрофагов в интерстиции и склерозированием стенки артериол можно трактовать как признаки хронического тубуло-интерстициального нефрита.

Результаты проведенного клинического исследования показали, что в фосфолипидном составе крови у детей наиболее существенные изменения отмечаются у больных с гломерулонефритами (особенно при нефротическом синдроме), которые получали продукты, содержащие тартразин чаще, чем несколько раз в месяц. Выявлено (табл.7) достоверное повышение уровней лизофосфатидилхолина (99,5±7,4 мг/л) и  фосфатидилинозитида (75,5±11,6 мг/л), более значащее снижение уровней негативно заряженных фосфолипидов (фосфатидилхолин - 267,3±12,9 мг/л, сфингомиелин - 177,2±21,5 мг/л) у детей с гломерулонефритами в сравнении с больными пиелонефритом (64,5±16,7 мг/л; 50,6±20,1 мг/л; 300,4±17,5 мг/л; 184,8±12,8 мг/л соответственно).  Отсутствие достоверных изменений концентраций других фракций фосфолипидов, возможно, обусловлена возможностью их к взаимопревращению, скоростью пластических  процессов детского организма. Изменения фосфолипидного спектра крови у детей с пиелонефритами зависели от степени активности воспаления, вовлечением в него интерстициальной ткани, функционального состояния почек. Результаты исследования свидетельствуют о наличии мембранных нарушений, которые зависят от тяжести заболевания и активности воспаления при гломерулонефритах и пиелонефритах.

Исследование содержания общих фосфолипидов в моче показало, что уровень их  существенно возрастает при нефротическом синдроме гломерулонефрита. Отмечена достоверная разница уровней гликозаминогликанов мочи – при гломерулонефритах (88,3±16 мкмоль/л) их уровень почти в 1,5 раза выше, чем при пиелонефритах (52,1±9,3 мкмоль/л). Эти изменения могут свидетельствовать не только о тяжести мембранных нарушений при гломерулонефритах, но и давать основание для предположения, что в развитии этой патологии имеет значение дисфункция соединительной ткани, клиническими проявлениями которой были выявлены признаки соединительно-тканной дисплазии.

Как свидетельствуют полученные данные, имеют место достоверные различия содержания ГАГ мочи, ЛФХ и ФИ крови у детей с гломерулонефритом и пиелонефритом, что свидетельствует о наиболее выраженных процессах дестабилизации клеточных мембран и соединительной ткани у детей с гломерулонефритом.

Анализ полученных данных выявил при гломерулонефритах у детей наличие достоверных положительных корреляционных связей между уровнями холестерину крови и ЛФХ (r=0,49, p<0,05), ФІ (r=0,74, p<0,05), уровнями общих ФЛ крови и ФИ (r=0,65, p<0,05), ЛФХ та ФИ крови (r=0,49, p<0,05). Также были выявлены отрицательные корреляционные связи  между уровнями ГАГ мочи и общих ФЛ крови (r=-0,47, p<0,05), ЛФХ та ФХ крови (r=-0,62, p<0,05).

Выявленные изменения в фосфолипидном составе крови, уровни гликозаминогликанов мочи у детей с гломерулонефритами и пиелонефритами, однонаправленные корреляционные связи между рядом показателей дают основание допустить, что в генезе этих изменений могут иметь место тубулярные нарушения, как фактор активности и тяжести воспалительного процесса. Кроме того, на изменения показателей дестабилизации клеточных мембран может влиять не только активность воспаления, вовлечение тубуло-интерстициальной ткани в патологический процесс, но и сочетанное действие различных факторов, в том числе и пищевых, что подтверждается экспериментальным исследованием.

Выводы:

1. Основываясь на результатах проведенного исследования, можно полагать, что влияние пищевых факторов, действующих на человека в течение всей жизни, выступают как токсические и ксенобиотические агенты, обусловливающие повреждение как гломерул почки, так и канальцевого эпителия, что приводит к развертыванию более интенсивной (но  неполноценной) регенерации почек со снижением их функциональных возможностей.

2. Внутриутробное начало действия повреждающих факторов намного усугубляет отрицательное воздействие, поскольку в течение периода эмбриофетогенеза происходит нарушение формирования почечных структур.

3.  Синтетические пищевые добавки в современных условиях жизни являются риск-фактором развития нефропатий у детей.

Список опубликованных работ по данной теме:

1. Вплив харчових факторів на розвиток нефропатій у дітей Вісник Української медичної стоматологічної академії / Ю. В. Одинець, В. О. Головачова, Г. І. Губіна–Вакулік [та ін.] // Вісник Української медичної стоматологічної академії. – 2008. –  Т. 8, №3 (23). – С. 26 –30.

2. Головачева В. А. Экзогенные факторы развития нефропатий у детей / Ю. В. Одинец, В. А. Головачева // Одеський медичний журнал. – 2009. – № 4 (114). – С. 29–33.

3. Головачова В. О. Вплив факторів зовнішнього середовища на фосфоліпідний спектр сироватки крові дітей, хворих на нефропатію / В. О. Головачова // Здоровье ребенка. – 2010. – № 3 (24). – С. 38–41.

4. Головачова В. О. Особливості фосфоліпідного спектра клітинних мембран у дітей, хворих на нефропатію / Ю. В. Одинець, В. О. Головачова, Т. В. Горбач // Медицина сьогодні і завтра. – 2010. – № 2–3 (47–48). – С. 150–154.

5. Пат. 51097 Україна, МПК А61В 10/00. Спосіб діагностики вторинної нефропатії у дітей / Одинець Ю. В., Головачова В. О.; заявник та патентовласник Харківський національний медичний університет. – № u 2010 03256 ; заявл. 22.03.10 ; опубл. 25.06.10, Бюл. № 12.

6. Особенности метаболических и морфологических изменений почек под действием пищевых факторов / Г. І. Губіна–Вакулік, Т. В. Горбач, В. О. Головачова [та ін.] // Проблемні питання діагностики та лікування дітей з соматичною патологією : Матеріали Української науково-практичної конференції. – Харків, 2008. – С. 35-37.

7. Головачова В. О. Вплив факторів зовнішнього середовища на особливості фосфоліпідного складу крові при патології нирок у дітей / Ю. В. Одинець, В. О. Головачова // Педіатрія, акушерство та гінекологія. – 2008. – №4 (428). – С. 105–106.

8. Экспериментальное обоснование возможности развития нефропатии у детей под действием пищевого красителя – тартразина / Ю. В. Одинець, Г.И. Губина-Вакулик, В. О. Головачова // Современные технологии в педиатрии и детской хирургии: Материалы VII Российского конгресса. – Москва, 2008. – С. 243-244.

9. Golovachova V. Influence of exogenous factors upon development of nephropathies in children / V. Golovachova // 2^nd International Scientific Interdisciplinary Congress for medical students and young doctors : аbstract book. – Kharkiv, 2009. – P. 117–118.

10. Головачева В. А. Проблемные вопросы заболеваний почек у детей / Ю. В. Одинец, В. А. Головачева // ІІІ з’їзд нефрологів України : тези доповідей. – Луганськ, 2009. – С. 129–130.

11. Головачова В. О. Вплив факторів зовнішнього середовища на розвиток захворювань нирок у дітей / В. О. Головачова // Внесок молодих спеціалістів у розвиток медичної науки і практики : матеріали всеукраїнської науково-практичної конференції. – Харків, 2011. – С. 25.